大豆皂苷Bb 對牙槽骨成骨細胞增殖、凋亡及MEK/ERK 通路的影響*

管琴，劉姣，陽劉康，任偉偉△

（1.湖北醫藥學院附屬東風口腔醫院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000）

骨質疏松癥是一種代謝性疾病，表現為骨量減少、骨微結構退化、骨脆性增加，易發生病理骨折［1-2］。牙槽骨骨質疏松可導致牙折、齲齒、牙種植失敗、牙脫落等口腔問題［3］，嚴重影響咀嚼、發音及面部形象。人牙槽骨成骨細胞（HAOB）是一種不成熟的成骨細胞，取材方便，具有體外增殖分化能力，可能成為組織工程中的種子細胞來源［4-5］。大豆皂苷亞型眾多，分為Ba，Bb，Bc，Bd，Be，而大豆中的大豆皂苷Bb具有與β-雌二醇相似的結構，能通過與雌激素受體（ERs）結合而表現出弱的雌激素作用［6］，其他亞型與雌激素不相關。體內大豆皂苷Bb可有效預防骨丟失，減輕骨脆性的增加，促進卵巢切除術引起的骨折愈合［7-8］。絲裂原細胞外信號調節激酶/ 細胞外信號調節激酶（MEK/ ERK）通路是力刺激下牙周膜細胞成骨分化的重要調控通路［9-10］。大豆皂苷Bb 對牙槽骨成骨細胞的作用及機制尚未見報道。本研究中探討了大豆皂苷Bb經MEK/ERK 信號通路對牙槽骨成骨細胞增殖、凋亡的影響，為牙槽骨骨質疏松的防治提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：貝克曼庫爾特Navios EX 型流式細胞儀（美國Beckman 公司）；Mx3005PCR 系統（美國Straagene 公司）；紅外成像系統（美國LI-COR公司）。

試藥：Dulbecco 改良的Eagle 培養基（DMEM，南京Wisent 公司，批號為DC-47156.36）；青霉素、鏈霉素（美國Sigma 公司，批號分別為WE-5489，2654）；大豆皂苷Bb（成都曼思特生物科技有限公司，批號為KJ542636）；雌二醇（廣東彼迪藥業有限公司，批號為45266934）；結晶紫（重慶市恒安化工有限公司，批號為20196365）；TRIzol 試劑盒（美國Life Technologies 公司，批號為NB-526.36）；逆轉錄試劑盒（批號為vo-1263.36），放射免疫沉淀試劑盒（RIPA，批號為459654.36），均購于美國Thermo Fisher Scientifc 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號為XO-52432.36），3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT，批號為6548536），膜聯蛋白V-FITC/ PI 染色試劑盒（批號為201963212.3.），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，批號為DI-365954.63），均購于上海碧云天生物技術有限公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國Bio-Rad 公司，批號為MN-56987.63）；EvaGreen 2×qPCR 試劑盒（批號為xc-52636.3），MEK一抗（1∶5 000，批號為652149），ERK 一抗（1∶2 000，批號為354219），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶5 000，批號為984251），均購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗（1∶2 000，中國Bioworld Technology 公司，批號為VC-415896.36）。

細胞：牙槽骨成骨細胞（美國典型培養物保藏中心，ATCC）。

1.2 方法

細胞培養：將所得牙槽骨成骨細胞懸液在DMEM中培養，加入100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素。培養環境基本參數為5%CO2、37 ℃、95%N2。

分組與給藥：對照組（A組）牙槽骨成骨細胞培養方法同細胞培養項下；雌二醇組（B 組）培養方法同對照組，加入雌二醇使最終質量濃度為400 μg/mL；大豆皂苷Bb 低、高劑量組（C1組、C2組）細胞培養方法同對照組，加入大豆皂苷Bb 使最終質量濃度分別為400，800 μg/mL。根據預試驗，取大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞半數有效量（ED50）1 600 μg/mL 確定低、高劑量水平分別為1/ 2ED50、1/ 4ED50。各組細胞分別設6 個平行樣，培養72 h。

細胞活力檢測：將培養結束的細胞接種至96 孔板（1× 104個細胞/孔），孵育24 h 直至細胞黏附，移出培養基，用含有60 μmol/L 的DMSO 作為載體對照的新鮮培養基代替，并將細胞再孵育48 h。向每個孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT，并將混合物在37 ℃、5%的CO2環境下溫育4 h，除去培養基，加入150 μL DMSO，溶解由活細胞從MTT 產生的甲基紫。采用ER-IU98型自動酶標儀于490 nm 波長處讀取光密度（OD）值。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

細胞菌落數測定：將培養結束的細胞以1 500個/孔的密度接種至6 孔板中，每3 d 更換1 次培養基。孵育15 d后，用甲醇固定可見菌落，用0.1%結晶紫染色，捕獲并計數。每組3個孔，每個測定獨立重復3次。

骨細胞凋亡水平測定：細胞培養結束后，將細胞與膜聯蛋白V-FITC/PI 染色試劑盒分別孵育10 min。采用貝克曼庫爾特Navios EX 型流式細胞儀分析牙槽骨成骨細胞的細胞凋亡率。每個測定獨立重復3次。

細胞MEK 和ERK 基因水平測定：使用TRIzol 試劑盒獲得總RNA，互補DNA（cDNA）使用逆轉錄試劑盒合成。為確定MEK和ERK mRNA的水平，使用EvaGreen 2×qPCR進行逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。熱循環如下：95 ℃，5 min；40 個循環，95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min。以GAPDH 為內部對照。使用2-ΔΔCt法計算相對RNA 表達。MEK，ERK，GAPDH 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：MEK 正義，5'-TCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGCTGACTGATATTCG-3'，反義，5'-CGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC-3；ERK 正義，5'-CGGGGAGCTAGTAGAGAGTCGATCGATCGATGCTAG CTA-3'，反義，5'-CGTAGCTAGTCAGTCAGTCGATCGATGTAGCTAGCTAGTC-3'；GAPDH 正義，5'-CG ATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGTAGCTAGCTAGCT-GATCG-3，反義，5'-TGTGCTAGTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATGCTAG-3'。

細胞MEK 和ERK 蛋白水平測定：采用RIPA 裂解培養結束的細胞。以12 000 ×g離心15 min，收集上清液，98 ℃變性20 min，通過Bradford 試劑盒對蛋白質進行定量。準備40 μg 蛋白質用于SDS-PAGE 作進一步分析，將凝膠轉移至0.22 μm PVDF 膜持續0.5 h，在磷酸鹽緩沖液（PBS）中孵育攜帶蛋白質的PVDF 膜與5%脫脂牛奶，并將膜與MEK，ERK，GAPDH 一抗在4 ℃孵育過夜，將PVDF 膜用HRP 偶聯的二抗以1∶50 000 稀釋，包被1 h。使用紅外成像系統檢測蛋白條帶，將蛋白質水平的半定量分析標準化為GAPDH水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對牙槽骨成骨細胞增殖和凋亡的影響

與A組比較，B組、C1組、C2組OD和細胞存活率均明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。與B 組比較，C1組OD和細胞存活率均明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），C2組OD、細胞存活率、細胞凋亡率均無明顯變化（P＞0.05）。詳見表1和圖1。

表1 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞增殖、凋亡和菌落數的影響（，n=6）Tab.1 Effect of soyasaponin Bb on the proliferation，apoptosis and colony count of alveolar osteoblasts（，n=6）

表1 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞增殖、凋亡和菌落數的影響（，n=6）Tab.1 Effect of soyasaponin Bb on the proliferation，apoptosis and colony count of alveolar osteoblasts（，n=6）

注：與A 組比較，aP ＜0.05；與B 組比較，bP ＜0.05；與C1組比較，cP ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the group A，aP ＜ 0.05；Compared with those in the group B，bP ＜ 0.05；Compared with those in the group C1，cP ＜0.05（for Tab.1-2）.

圖1 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of soyasaponin Bb on the apoptosis of alveolar osteoblasts

2.2 對牙槽骨成骨細胞菌落數的影響

與A 組比較，B 組、C1組、C2組菌落數均明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。與B組比較，C1組菌落數明顯降低（P＜0.05），C2組菌落數無明顯變化（P＞0.05）。詳見表1和圖2。

圖2 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞菌落的影響（結晶紫染色，×200）Fig.2 Effect of soyasaponin Bb on the colony of alveolar osteoblasts（crystal violet staining，× 200）

2.3 對MEK，ERK mRNA 和蛋白表達水平的影響

與A組比較，B組、C1組、C2組牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。與B組比較，C1組牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），C2組牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA和蛋白表達水平均無明顯變化（P＞0.05）。詳見表2和圖3。

表2 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA和蛋白表達水平的影響（，n=6）Tab.2 Effect of soyasaponin Bb on the expression levels of MEK，ERK mRNA and protein of alveolar osteoblasts（，n=6）

表2 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA和蛋白表達水平的影響（，n=6）Tab.2 Effect of soyasaponin Bb on the expression levels of MEK，ERK mRNA and protein of alveolar osteoblasts（，n=6）

圖3 大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞MEK，ERK蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of soyasaponin Bb on the expression levels of MEK and ERK protein of alveolar osteoblasts

3 討論

3.1 大豆皂苷Bb 對牙槽骨成骨細胞增殖、凋亡的影響

本研究結果顯示，與A 組比較，B 組、C1組、C2組OD、細胞存活率、菌落數均明顯升高，細胞凋亡率均明顯降低；且隨著大豆皂苷Bb劑量的增加，各組OD、細胞存活率、菌落數均逐漸升高，細胞凋亡率均逐漸降低，表明大豆皂苷Bb 能促進牙槽骨成骨細胞增殖，抑制凋亡。絕經后婦女牙周炎牙槽骨丟失由口腔不良微生物和體內雌激素降低綜合導致，治療方法為消除炎性因素并提高體內雌激素水平。一項大鼠實驗表明，大豆皂苷Bb 為具有骨骼保護作用的天然抗氧化劑，并具有雌激素效應。本研究結果表明，12 mg/ kg 和24 mg/ kg 的大豆皂苷Bb 可明顯減少牙槽骨丟失，減少TRAP 陽性破骨細胞和炎性細胞計數，同時增加成骨細能計數［11］。此外，大豆皂苷Bb 通過升高骨成型蛋白4（BMP-4）水平而誘導成骨細胞活性增加，還通過降低胱天蛋白酶3（caspase-3）和增加B 淋巴細胞瘤-2 基因（bcl-2）的表達而抑制成骨細胞凋亡［11-12］。在嚴重炎癥的骨質疏松模型大鼠中，大豆皂苷Bb 以2.5～15.0 mg/ kg 的劑量有效預防炎癥和骨破壞［13］。除抗炎外，大豆皂苷Bb還通過抑制TRAP 陽性破骨細胞的形成而具有抗破骨活性［14］，且可增加骨質疏松模型小鼠的骨礦物質密度。

3.2 大豆皂苷Bb 對牙槽骨成骨細胞的增殖、凋亡機制

大豆皂苷Bb的骨保護作用可能是通過上調誘導成骨作用下核因子-κB（NF-κB）受體激活劑（RANKL），Ⅰ型膠原蛋白和骨保護素的表達而產生的［15］。骨形成的過程與成骨細胞的初始生存能力，堿性磷酸酶（ALP）活性和膠原蛋白含量增加，細胞外基質的發育和成熟及最終礦化密切相關［16］。ALP 和Ⅰ型膠原蛋白的活性是成骨細胞表型的早期分化標志，對調節細胞成熟和礦化非常重要［17］。大豆皂苷Bb可能通過調節ALP和Ⅰ型膠原蛋白的活性，顯著促進成骨細胞的增殖。MEK/ERK 信號通路是有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）級聯的原型，在成骨細胞的生長、分化和成熟等方面起重要作用［18］。本研究結果顯示，與A組比較，B組、C1組、C2組牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；且隨著大豆皂苷Bb 劑量的增加，各組牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA 和蛋白表達水平均逐漸升高（P＜0.05），表明大豆皂苷Bb 促進牙槽骨成骨細胞MEK，ERK mRNA 和蛋白表達水平，激活MEK/ ERK 信號通路傳導，可磷酸化激活MEK 及ERK1/2，最終導致下游事件和細胞功能發生變化，參與牙槽骨成骨細胞分化和骨再生。使用U0126抑制劑阻斷MEK/ERK 信號傳導會明顯降低成骨細胞ALP 活性和骨鈣蛋白（OCN）、矮小相關轉錄因子2（Runx2）、BMP等成骨相關基因的表達，進而抑制成骨細胞的增殖［19-20］。本研究中未探討大豆皂苷Bb對牙槽骨成骨細胞Runx2，OCN，BMP 表達的影響，未證實成骨細胞通過MEK/ERK信號通路產生后續作用，在后續研究中將設置對應敲除/抑制模型進行深入研究。