鹿茸多肽對訓練創傷致脊髓損傷模型大鼠的作用及機制*

廖軍鋒，王虹，龍桂花，呂曉宇△，蘇建

（1.中國人民解放軍南部戰區總醫院，廣東 廣州 510010；2.廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095）

軍事訓練或體育訓練過程中，防護不當、訓練方法不科學或意外均易導致脊柱骨折，并伴隨脊髓損傷（SCI）［1］。SCI 引發的神經性疼痛是一種嚴重的慢性疼痛［2］，目前已有關于SCI 致神經性疼痛的治療方案和潛在作用機制研究，但其治療仍具有極大挑戰［3］。臨床常用非甾體抗炎藥、阿片類藥物及其衍生物治療疼痛［4］，對急性疼痛有一定療效，但無法治愈神經性疼痛［5］。研究表明，神經損傷或SCI在脊髓中誘導促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族c-Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）和p38 等的深度活化［6］。故選擇合適的靶分子抑制MAPK的激活可能是一種有效的鎮痛策略。多聚嘧啶序列結合蛋白（PTB）是一種重要的神經元分化調節蛋白［7］，可誘導膠質細胞分化為神經元，在神經退行性疾病中發揮神經元保護作用［8］。另外，PTB 通過與早期生長應答因子2（EGR2）結合，可調節白細胞介素1β（IL-1β）和p38-MAPK的信號通路［9］。但尚不明確PTB對SCI的修復作用，故尋找安全、有效的分子抑制PTB 可能是治療SCI 的有效方法。鹿茸多肽（VAP）提取于鹿茸，是一種富含生物活性多肽的混合物。《本草綱目》記載，鹿茸具有補腎養骨、延年益壽的功效。VAP 被廣泛用于增強性功能，抑制炎癥，促進軟骨細胞增殖，延緩衰老，對神經細胞分化的促進功能明顯［10］，在治療骨關節炎疾病中發揮關鍵作用［11］。本研究中探討了VAP 對訓練創傷致SCI 模型大鼠痛覺、神經炎癥及PTB 介導神經修復作用的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Von Frey纖維絲（上海玉研科研儀器有限公司，型號為NC12775-01 至NC12775-20，質量為0.008～300.000 g）；37300 型輻射熱刺痛儀（意大利UGO Basile公司）；GE LAS 4000 mini 型分子成像儀（美國GE 公司）；CKX53 型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Lecia CM1860 UV型冷凍切片機（徠卡生物系統有限公司）。

試藥：MSI-1436（PTB 抑制劑，美國MCE 公司，批號為HY-12219A，純度不低于95.0%）；VAP（上海德翅生物科技有限公司，批號為DC168002011，純度不低于98.0%）；磷酸化p38（p-p38）抗體（Tyr182，批號為4511，1∶800），PTB 抗體（批號為72669，1∶1 000），磷酸化胞外信號調節激酶（p-ERK）1/ 2 抗體（Thr202/Tyr204，批號為9101，1∶1 000），磷酸化JNK（p-JNK）抗體（Thr183/Tyr185，批號為4668，1∶1 000），抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）辣根過氧化物酶（HRP）抗體（二抗，批號為7074，1∶3 000），抗兔IgG HRP 抗體（二抗，批號為7076，1∶3 000），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為SAB1410512，1∶5 000）；神經元特異性烯醇化酶（NSE）抗體（批號為ab180943，1∶100），IL-1β抗體（批號為ab216995，1∶1 000），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體（批號為ab109322，1∶1 000），均購自美國Abcam 公司；熒光二抗Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG試劑盒（美國Jackson Laboratories公司，批號為711-547-003，1∶300）。

動物：無特定病原體（SPF）成年雄性SD大鼠，48只，6 周齡，體質量206～229 g，動物生產許可證號為26-2001A008，購于廣東省醫學實驗動物中心。在無病原飼養條件下，每籠養5～6只，維持室溫為（22±2）℃，12 h/12 h明暗循環。所有動物的使用均通過中國人民解放軍南部戰區總醫院動物護理和使用委員會的審查和批準，并嚴格遵守國際疼痛研究協會（IASP）清醒動物疼痛實驗守則。

1.2 方法

分組、建模［12］與給藥：將48 只SD 大鼠隨機分為空白（Control）組，模型（SCI）組，陽性對照（MSI-1436）組及VAP 低、中、高劑量組（20，40，60 mg/kg），各8 只。適應性飼養2 d后，用4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于后右側大腿中部暴露坐骨神經7 mm，在暴露的7 mm 坐骨神經段中間每隔1 mm選1個位置，共選擇4個位置使用4-0鉻色腸線進行結扎，然后逐層縫合。Control 組大鼠暴露坐骨神經后不進行結扎，直接進行逐層縫合。建模成功后，Control 組、SCI 組大鼠不給予藥物治療，僅給予等量生理鹽水；MSI-1436 組大鼠術后14 d 鞘內注射4 μg MSI-1436（溶于20 μL 生理鹽水）1 次（單次給藥），并于術后15，16 d 各給藥1 次（連續給藥）；VAP 低、中、高劑量組大鼠術后14 d 分別腹腔注射20，40，60 mg/ kg VAP 1 次（單次給藥），并于術后15，16，17，18 d 各給藥1 次（連續給藥）。

SCI 相關疼痛行為評估：適應性飼養2 d后，在正式測試前1 d 進行基線測試。通過Von Frey 纖維絲測定大鼠機械痛覺閾值，取大鼠置架于金屬網上的塑料盒子中適應30 min，用一組質量為0.008～26.000 g的Von Frey纖維絲垂直刺激每只大鼠手術側后足的足底表面，記錄大鼠抬足時使用的纖維絲刻度值，排除大鼠自主性抬足。每只大鼠測試3遍，并計算平均值。測試大鼠足底對熱刺激的縮足潛伏期，使用輻射熱刺痛儀提供熱源，取大鼠置光滑且可控溫度的玻璃地板的盒子中，將熱源聚焦在后足底表面，向該部位傳遞輻射熱刺激（保持恒定），后足縮回時關閉刺激，記錄抬足的熱痛覺潛伏期，排除大鼠自主性抬足。每只大鼠測試3遍，并計算平均值。

免疫印跡（Western blot）法檢測PTB 和MAPK 信號通路p-JNK，p-p38，p-ERK 及促炎因子IL-1β，TNF-α蛋白的表達水平：取L1-6處脊髓段，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，勻漿后在蛋白裂解緩沖液中裂解，將裂解物經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電泳轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下用5%胎牛血清白蛋白封膜1 h，4 ℃下同一抗［p-p38 抗體（Tyr182，1∶800），PTB 抗體（1∶1 000），p-ERK 1/2抗體（Thr202/Tyr204，1∶1 000），p-JNK 抗體（Thr183/ Tyr185，1∶1 000），GAPDH 抗體（1∶5 000）］孵育過夜，隨后與二抗［抗小鼠IgG HRP抗體（1∶3 000）或抗兔IgG HRP抗體（1∶3 000）］室溫孵育2 h。經增強型化學發光（ECL）顯色液顯色后，使用分子成像儀進行成像、拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析數據［11］。

免疫熒光化學法定位NSE：大鼠經水合氯醛深度麻醉后，心臟灌注PBS，注入4%多聚甲醛，將L4-5 腰節切開并固定在多聚甲醛中，使用冷凍切片機切成20 μm厚度的切片，將切片與抗NSE 抗體（1∶100）于4 ℃孵育過夜，隨后用PBS洗滌，并與二抗Alexa Fluor 488 Affini-Pure Donkey Anti-Rabbit IgG 室溫孵育2 h。用PBS 洗滌，在熒光顯微鏡下觀察其NSE免疫熒光染色情況［13］。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 鎮痛作用及對p-JNK，p-p38，p-ERK 蛋白表達水平的影響

SCI模型構建：與Control組比較，SCI組大鼠的機械痛覺閾值在術后17 d 降至最低，熱痛覺潛伏期在術后14 d 降至最低，并持續至術后21 d（t=18.261，14.227，P=0.024，0.031），詳見圖1 A 和圖1 B。與Control 組比較，SCI 組大鼠脊髓中PTB 蛋白表達水平顯著升高（t=20.320，P=0.003），詳見圖1 C 和圖1 D。結果表明，SCI模型構建成功。

鎮痛作用：1）單次給藥。考察SCI 術后14 d 給藥0，0.5，2.0，4.0，8.0，24.0 h 時大鼠的機械痛覺閾值和熱痛覺潛伏期。與SCI 組比較，MSI-1436 組及VAP 中、高劑量組大鼠單次給藥2.0，4.0，8.0 h 時同側足的機械痛覺閾值均顯著升高，熱痛覺潛伏期均顯著延長（F=126.029，205.663，P=0.000，0.002；F=152.554，203.431，P=0.021，0.003）。詳見圖2 A、圖2 B、圖3 A和圖3 B。2）連續給藥。考察SCI 術后連續給藥3，5 d，每天給藥2.0 h 時大鼠的機械痛覺閾值和熱痛覺潛伏期。與SCI 組比較，MSI-1436 組大鼠連續給藥3 d 及VAP中劑量組大鼠連續給藥5 d時同側足的機械痛覺閾值均顯著升高，熱痛覺潛伏期均顯著延長（F=216.011，128.052，P=0.002，0.009；F=139.028，188.122，P=0.019，0.006）。詳見圖2 C、圖2 D、圖3 C 和圖3 D。結果表明，VAP可減輕SCI誘導的疼痛反應。

注：與Control組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。圖2至圖4同。A.機械痛覺閾值 B.熱痛覺潛伏期 C，D.PTB蛋白表達水平圖1 SCI模型大鼠疼痛行為和PTB蛋白表達水平比較Note：Compared with those in the Control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1-4）.A.Mechanical pain threshold B.Thermal pain latency C，D.Expression level of PTBFig.1 Comparison of pain behavior and PTB expression level in SCI model rats

對MAPK 激酶的作用：與Control 組比較，SCI 組大鼠脊髓中p-p38，p-JNK，p-ERK 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與SCI 組比較，MSI-1436 組和VAP低、中、高劑量組大鼠脊髓中p-p38 和p-JNK 蛋白表達水平均顯著降低（F=133.080，156.233，P=0.026，0.015；F=188.380，192.106，P=0.002，0.011）。詳見圖2 E 和圖2 F。與SCI 組比較，VAP 低、中、高劑量組大鼠脊髓中給藥8 h后的p-p38和p-JNK 蛋白表達水平均顯著降低（F=188.380，192.106，P=0.002，0.011），給藥2 h 后的PTB 蛋白表達水平均顯著降低（F=152.080，P=0.022）。詳見圖3 E、圖3 F、圖3 G 和圖3H。結果表明，VAP 可逆轉SCI 誘導的PTB 和MAPK 激酶表達水平的升高。

2.2 對脊髓神經的修復作用

與Control 組比較，SCI組大鼠脊髓中NSE 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與SCI 組比較，VAP 中、高劑量組大鼠脊髓中NSE 的表達水平顯著降低（P=0.015，0.023）。詳見圖4 A 和圖4 B。結果表明，VAP 對SCI模型大鼠的脊髓神經具有修復作用。

2.3 可抑制脊髓神經的炎性反應

與Control 組比較，SCI 組大鼠脊髓中IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與SCI組比較，VAP低、中、高劑量組大鼠脊髓中IL-1β和TNF-α蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖4 C 和圖4 D。結果表明，VAP可抑制SCI誘導的脊髓神經的炎性反應。

3 討論

PTB蛋白是一種聚嘧啶束結合蛋白，主要表達于神經系統。神經發育過程中，PTB表達上調，而當神經元成熟時，PTB 的表達水平反而降低。此程序對神經系統的發育至關重要，故PTB 在神經元誘導和保護神經元的成熟中起著重要作用。目前，已發現敲除PTB 為非神經元細胞轉化為神經元的必要充分條件［14］。另外，氧化應激、TNF-α 刺激等外界刺激可使絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域磷酸化，并激活PTB［15］。

研究表明，MAPK 特別是JNK 和p38 的激活，可導致神經病理性疼痛［16］，慢性收縮引起的坐骨神經損傷可誘導脊髓背角JNK 和p38 的顯著活化［17］。嚙齒動物模型中，p38 抑制劑和JNK 抑制劑可改善神經性疼痛癥狀［18-19］。作為JNK 和p38 的上游，抑制PTB 可明顯降低炎性疾病中IL-1β 和p38-MAPK 的表達水平［20］。但有關PTB 在慢性疼痛中作用的研究極有限。故本研究中設計了相關實驗，以評估PTB 在SCI誘導的神經性疼痛中的作用，發現SCI可引起大鼠明顯的機械異常性疼痛和熱痛覺過敏，誘導腰部脊髓PTB的上調，故本研究中探討了PTB激活對SCI誘導的神經性疼痛是否具有功能意義。結果顯示，單次給藥或連續給藥PTB抑制劑MSI-1436均可顯著減輕SCI 引起的機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏；顯著抑制SCI 誘導的p-JNK 和p-p38 的上調，但對p-ERK 表達水平無明顯影響，表明PTB 是JNK 和p38 而非ERK 的上游調節劑。同時，發現VAP 可有效抑制SCI 誘導的PTB 表達水平的升高，從而抑制PTB 蛋白在脊髓中的表達。由此可知，VAP 可通過抑制PTB 減輕SCI誘導的神經性疼痛。

A，B.單次給藥機械痛覺閾值和熱痛覺潛伏期 C，D.連續給藥機械痛覺閾值和熱痛覺潛伏期 E，F.給藥8 h后p-JNK，p-p38，p-ERK蛋白表達水平 G，H.給藥2 h后PTB蛋白表達水平圖3 VAP對SCI模型大鼠疼痛行為和p-JNK，p-p38，p-ERK，PTB蛋白表達水平的影響A，B.Mechanical pain threshold and thermal pain latency after the single administration C，D.Mechanical pain threshold and thermal pain latency after the continuous administration E，F.Expression levels of p-JNK，p-p38 and p-ERK proteins 8 h after administration G，H.Expression level of PTB 2 h after administrationFig.3 Effects of VAP on the pain behavior and expression levels of p-JNK，p-p38，p-ERK and PTB in SCI model rats

PTB在神經元和神經膠質細胞中均有表達，并在神經炎癥的誘導和維持中起重要作用。研究發現，抑制PTB 可減少神經膠質細胞中TNF-α，IL-1β 等炎性因子的釋放［8-9，20］。這些炎性因子均是疼痛致敏過程中的重要介質。本研究結果顯示，VAP 在SCI 中顯著抑制了神經損傷標志物NSE 的高表達，并抑制了TNF-α 和IL-1β的表達。

A.NSE病理生理圖 B.NSE蛋白表達水平 C，D.IL-1β和TNF-α蛋白表達水平圖4 VAP對SCI誘導的神經損傷和炎性因子表達水平的影響A.Diagram of NSE pathophysiology B.Expression level of NSE protein C，D.Expression levels of IL-1β and TNF-α proteinsFig.4 Effect of VAP on the SCI-induced nerve injury and expression levels of inflammatory factors

綜上所述，VAP 下調了SCI 誘導的PTB 蛋白表達水平的升高，可預防神經性疼痛相關的異常性疼痛和熱痛覺過敏，促進神經修復，并減輕炎癥。