復方溶石劑對膽結石模型小鼠的作用及機制*

湯杰，陳國裕，姚瑤，常云麗，季潔如，胥明

（上海市浦東新區人民醫院，上海 201299）

膽結石病為常見消化系統疾病，90%以上的膽結石是膽囊內形成的膽固醇固體結晶［1］。正常生理狀態下，膽汁在肝臟產生并分泌到十二指腸消化食物［2］。病理生理條件下，膽固醇的過飽和膽汁和相對過量的膽固醇會沉淀為固體晶體，在膽囊分泌的黏蛋白凝膠中聚集、融合，最終形成膽結石［3］。腹腔鏡膽囊切除術是目前治療有癥狀膽結石的金標準，膽固醇膽結石疾病的藥物治療方案尚無統一標準。有研究表明，抑制肝臟膽固醇合成或腸道膽固醇吸收的降膽固醇藥物可作用于參與膽固醇和膽汁酸穩態的特定核受體，從而治療膽固醇膽結石疾病［4］。復方溶石劑按2-甲氧基-6-甲基吡啶（MMP）-依地酸二鈉（EDTA）-聚乙二醇（PEG）-蛋黃卵磷脂（EPC）濃度梯度1∶1∶1∶1配制，其酯類溶解劑與主要溶解色素結石的金屬離子螯合劑通過表面活性劑或乳化劑混合，能同時較好地溶解膽結石的膽固醇和膽色素成分［5］。由于不同溶劑的配合使用及表面活性劑的加入，使溶石劑的有效濃度下降，減少了溶石劑生物毒性及副作用的發生。加入中藥等黏膜保護成分，可提高患者的耐受性和依從性［6-7］。本研究中探討了復方溶石劑對膽結石模型小鼠的作用及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：AU-480 型全自動生化分析儀（美國庫爾特貝克曼生物科技有限公司）；FTC-3000P 型實時聚合酶鏈式反應（PCR）系統（上海風菱生物技術有限公司）；E-Gel 96 型凝膠成像儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Image-Pro Plus 軟件（6.0版，美國Media Cybernetics公司）。

試藥：復方溶石劑（本院中醫科研制）；熊去氧膽酸（美國Sigma 生物公司，批號為MN-54898）；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽紅素（TBiL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽汁酸（TBA）、直接膽紅素（DBiL）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（美國庫爾特貝克曼生物科技有限公司，批號分別為695874，741854，258415，652148，201599，201598，635298，745261，203591）；PARIS?試劑盒（批號為45958），TRIzol?試劑（批號為514596），TRIzol LS 試劑（批號為632548），均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；cDNA逆轉錄試劑盒（德國Roche Diagnostics 公司，批號為201256）；SYBR Premix ExTaq 試劑盒（批號為5148965），RIPA 試劑（批號為2012569），均購自上海碧云天生物技術研究所；肝臟X受體（LXR）一抗（1∶2 000，批號為ab40855），羥基甲戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）一抗（1∶5 000，批號為ab96581），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶1 000，批號為ab32548），辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗兔二抗（1∶2 000，批號為ab96587），均購自英國Abcam 公司；增強型化學發光（ECL）試劑（美國Bio-Rad Laboratories公司，批號為412593）。

動物：BALB/ C小鼠100只，12 周齡，體質 量（108.65±12.09）g，雌雄各半，由山東大學醫學院動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK（魯）20001003。小鼠自由攝取飼料、自由飲水，晝夜循環（12 h/12 h），室溫（22±1）℃，符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 方法

分組、建模與給藥：將100 只小鼠按體質量隨機分為正常對照組（A 組），模型對照組（B 組），復方溶石劑低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組，2.5，5.0，20.0 mg/kg），各20只，雌雄各半。除A 組外，其余各組小鼠均予高脂、高熱量、高膽固醇（脂肪15%、膽固醇1%、膽酸0.5%）飼料，連續8周，建模成功后，B 組、C1組、C2組、C3組小鼠行腹部B超，均見明顯膽結石。C1組、C2組、C3組小鼠分別灌胃相應劑量藥物，A 組和B 組小鼠均灌胃等量生理鹽水，連續28 d。然后處死小鼠，分離血清及肝臟組織并進行相關檢測。

血清肝功能指標測定：應用AU-480 型全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中TG，TC，LDL-C，TBiL，DBiL，TBA，ALT，AST，ALP水平。

肝臟病理組織觀察：在4%多聚甲醛中固定，從右下葉制備3 mm 厚的切片，用石蠟包埋，將切片切成5 μm，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，以進行組織學分析，所有切片均使用Olympus 光學顯微鏡以400 倍的放大倍率成像。在每個切片的6個隨機選擇的區域中進行組織病理學分析，以間質水腫、出血、中性粒細胞浸潤、透明膜形成、壞死和充血評估肝臟損傷程度。

小鼠肝臟組織中LXR 和HMGCR mRNA 表達水平測定：使用PARIS?試劑盒將肝臟組織與1 mL細胞分級緩沖液混合，在室溫下以3 800×g離心20 min，獨立使用TRIzol?試劑和TRIzol LS 試劑從上清液中獲得總RNA，使用cDNA逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，使用SYBR Premix ExTaq 試劑盒和FTC-3000P 型實時PCR 系統進行實時熒光定量PCR（qPCR）。熱循環條件：95 ℃初始變性20 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共40 個循環。引物序列見表1，以GAPDH 用作LXR 和HMGCR的內參，使用2-ΔΔCt計算LXR 和HMGCR的相對表達量。

免疫印跡（Western blot）法檢測LXR 和HMGCR 在小鼠肝臟組織中的蛋白表達水平：使用RIPA 試劑從肝臟中提取總蛋白，蛋白質濃度由BCA 法確定，通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質（30 μg），并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜與針對LXR，HMGCR，GAPDH 的一抗在4 ℃下孵育12 h，用含有0.05%Tween-20 的TBS 洗滌3次，將膜與HRP 偶聯的山羊抗兔二抗在37 ℃下孵育1 h，用凝膠成像儀和ECL觀察蛋白質條帶，采用Image-Pro Plus 6.0版軟件計算目標蛋白/內部參考蛋白的灰度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對小鼠肝功能指標的影響

與A 組比較，B 組小鼠血清TG，TC，LDL-C，TBiL，DBiL，TBA，ALT，AST，ALP水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組小鼠血清TG，TC，LDL-C，TBiL，DBiL，TBA，ALT，AST，ALP水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表2。

表2 復方溶石劑對小鼠肝功能指標的影響（，n=20）Tab.2 Effect of compound litholytic preparation on the liver function indexes of mice（，n=20）

表2 復方溶石劑對小鼠肝功能指標的影響（，n=20）Tab.2 Effect of compound litholytic preparation on the liver function indexes of mice（，n=20）

注：與A組比較，aP ＜0.05；與B組比較，bP ＜0.05；與C1組比較，cP ＜0.05；與C2組比較，dP ＜0.05。表3同。Note：Compared with those in the group A，aP ＜0.05；Compared with those in the group B，bP ＜0.05；Compared with those in the group C1，cP ＜0.05；Compared with those in the group C2，dP ＜0.05（for Tab.2-3）.

2.2 肝臟病理切片結果

A組小鼠肝細胞結構清晰，膽管區無明顯異常；B組小鼠膽管上皮細胞壞死明顯，有炎性細胞浸潤；C1組、C2組、C3組小鼠肝細胞結構逐漸恢復正常，膽管上皮細胞壞死減少，且呈劑量-效應關系。詳見圖1。

2.3 對小鼠肝臟LXR 和HMGCR mRNA 及蛋白表達水平的影響

與A 組比較，B 組小鼠肝臟LXR mRNA 及蛋白表達水平均顯著降低，HMGCR mRNA 及蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠肝臟LXR mRNA 及蛋白表達水平均顯著升高，HMGCR mRNA及蛋白表達水平均顯著降低，且均呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表3和圖2。

圖2 各組小鼠肝臟LXR和HMGCR蛋白表達免疫印跡圖Fig.2 Western blot of LXR and HMGCR protein expression in liver in each group

表3 復方溶石劑對小鼠肝臟LXR和HMGCR mRNA及蛋白表達水平的影響（n=20）Tab.3 Effect of compound litholytic preparation on the expression levels of LXR and HMGCR mRNA and protein in liver of mice（n=20）

3 討論

隨著高脂、高膽固醇進食時間的延長，膽結石患病率和肝臟惡化程度逐漸增加。本研究結果顯示，與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠TG，TC，LDL-C，TBiL，DBiL，TBA，ALT，AST，ALP 水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05），表明復方溶石劑在降低膽固醇飽和指數和膽固醇膽結石形成方面具有明顯作用。

注：虛線箭頭為膽管區域；實線箭頭為肝細胞脂肪病變。圖1 各組小鼠肝臟病理切片結果（HE染色，×400，n=20）Note：The dotted arrow refers to the bile duct area，and the solid arrow refers to the liver steatosis.Fig.1 Results of pathological sections of liver in each group（HE staining，×400，n=20）

本研究結果顯示，與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠肝臟LXR mRNA 及蛋白表達水平均顯著升高，HMGCR mRNA 及蛋白表達水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05），表明復方溶石劑能上調膽結石模型小鼠肝臟LXR 表達，下調HMGCR 表達。LXR 是膽固醇傳感器，響應過量的膽固醇，刺激其轉運到肝臟和膽汁排泄，其作用機制可能為當復方溶石劑進入膽汁時，其會改變膽汁鹽濃度并增加膽固醇的溶解度。復方溶石劑可溶解膽汁中的膽固醇結石/晶體，還可刺激LXR將膽固醇向前輸送到膽汁中［8］。LXR 作為一種膽固醇受體，在膽固醇轉運增加時被動下調，以維持膽固醇穩態；同時，不依賴HMGCR 的途徑在調節肝臟膽固醇分泌和確定對膽固醇膽結石的易感性方面起關鍵作用［9］。這與LXR-HMGCR 通路調節膽固醇代謝的經典作用機制不同，因為膽鹽濃度有限，當濃度達到一定水平時會影響膽固醇的溶解度，導致膽固醇結晶/ 結石形成［10-12］。這也可能是復方溶石劑并非對每個患者都有效，或一段時間后結石會復發，需在后續研究中驗證。

綜上所述，復方溶石劑能減輕膽結石模型小鼠的肝臟脂肪變性，調節膽固醇及血脂，其機制可能與復方溶石劑能下調HMGCR表達和上調LXR表達有關。