表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制人腹膜間皮細胞上皮-間質轉化的作用及機制*

謝斌，洪慧，帥歡，張林

（1.湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院，湖南 株洲 412000；2.湖南省長沙市第四醫院，湖南 長沙 410006）

腹膜透析（PD）是終末期腎病的替代療法，占全球所有形式腎病替代治療的10%以上［1］。上皮-間質轉化（EMT）是上皮細胞在高糖、轉化生長因子-β（TGF-β）等因素誘導下，上皮細胞特異性標志物表達喪失，并獲得肌成纖維細胞表型的過程［2］。人腹膜間皮細胞（HPMCs）被認為是腹膜纖維化的核心機制［3］。腹膜纖維化的發生會導致PD 失敗，極大地限制了PD 的應用。綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶多酚的主要單體及活性成分，其化學結構中包含沒食子酰側鏈，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物學特性［4］。最新的研究發現，EGCG 可通過增加細胞內自噬而抑制人成纖維細胞的肌成纖維細胞轉化［5］。PANJI等［6］研究發現，EGCG 通過活性氧（ROS）/Smad 信號傳導抑制TGF-β 誘導的人宮頸癌細胞EMT。Notch 是編碼哺乳動物細胞中跨膜受體家族的一組基因，主要調控細胞的增殖、分化和凋亡，影響細胞的正常生長，在機體穩態、血管生成和癌癥發生中起重要作用，Notch受體家族有4 個成員，其中Notch 受體3（Notch3）較常見［7］。ZHU等［8］的研究結果顯示，EGCG通過靶向抑制Notch信號通路，抑制鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型小鼠的腎纖維化過程，提示EGCG可能是一種潛在的抗纖維化試劑，可調節細胞EMT過程。本研究中通過體外建立晚期糖基化終產物（AGEs）誘導的HPMCs EMT 的模型，并采用綠茶提取物EGCG 對EMT過程進行干預，探討EGCG 對保護腹膜超濾功能的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

腹膜來源于新開管的PD和PD 1年以上患者，獲取的腹膜標本立即放入D-Hank液中低溫保存，短時間內處理。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案經湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 細胞與試藥

細胞：HPMCs 細胞株HMrSV5（中國科學院上海細胞庫，批號為XY-XB-1663）。

試藥：EGCG（上海源葉公司，批號為B20106）；AGEs（美國Biovision公司，批號為4271-100）；Dulbecco改良Eagel 培養基（DMEM，批號為SH30243），牛血清白蛋白（FBS，批號為SH30070.03），均購自美國Hyclone公司；Ham's F12 培養基（批號為31765035），LipofectamineTM2000（批號為11668019），均購自美國Thermo Fisher 公司；逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒（RNA 提取試劑，批號為R401-01），逆轉錄試劑盒（批號為R223-01），SYBR Green試劑（批號為Q221-01），CCK-8試劑盒（批號為A311-01），均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；緊密連接蛋白1（ZO-1）抗體（批號為ab276131），E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（批號為ab40772），鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）抗體（批號為ab197896），Notch3 抗體（批號為ab300527），均購自英國Abcam公司；si-NC，si-Notch3（美國Invitrogen公司）；ZO-1，E-cadherin，FSP1，Notch3 引物，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物，均購自生工生物工程（上海）公司。

1.3 方法

原代細胞提取和培養：將無菌腹膜組織移入燒杯中，加入預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌2次，剝離多余的脂肪組織及血管，PBS 沖洗至無油珠漂浮，將網膜組織平鋪于無菌培養皿，剪成0.7 cm×0.7 cm 大小，加入胰蛋白酶和0.02%依地酸二鈉（EDTA）消化液，用吸管反復吹打均勻，移入細胞培養瓶內消化25 min，每5 min 振搖1次，消化結束后，將消化液經100 目濾網過濾于燒杯中，加入Ham's F12 完全培養基終止消化，離心，收集細胞，將細胞鋪至細胞培養皿中，在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，得到原代HPMCs。HMrSV5 用含15%FBS的DMEM，在5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，細胞密度達80%時用胰酶消化細胞，顯微鏡下觀察到大部分細胞變圓時終止消化，加入新鮮培養基，每隔2 d 更換1 次新鮮培養基，待細胞生長密度達80%時進行消化和傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

AGEs 誘導的HPMCs EMT：AGEs 誘導HMrSV5 的EMT 模型，將細胞分為1 組（正常HMrSV5，培養基不加AGEs）、2 組（加入200 μg/ mL AGEs 誘導HMrSV5）、3組（加入500 μg/mL AGEs 誘導HMrSV5）［9］，培養72 h后收集細胞，檢測ZO-1，E-cadherin，FSP1 的mRNA和蛋白表達水平。

qRT-PCR法檢測HPMCs中的ZO-1，E-cadherin，FSP1，Notch3 mRNA 表達水平及相關性：TRIzol 試劑提取原代HPMCs 和HMrSV5 中的總RNA，酶標儀檢測總RNA 的純度和含量，按qRT-PCR 試劑盒說明，依次進行逆轉錄和qRT-PCR 實驗。qRT-PCR 反應體系為cDNA 模板2 ng，上下游引物各0.4 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O 補充至10 μL；qRT-PCR 反應條件為預變性95 ℃（30 s），變性95 ℃（7 s），退火55 ℃（30 s），延伸72 ℃（15 s），40 個循環周期。擴增結果根據2-ΔΔCt法計算mRNA 的相對表達量，采用Spearman 相關性分析ZO-1，E-cadherin，FSP1，Notch3 mRNA 表達的相關性。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

免疫印跡（Western blot）法檢測HPMCs 中ZO-1，E-cadherin，FSP1，Notch3 的蛋白表達水平：收集各組細胞，使用RIPA 裂解提取總蛋白，通過BCA 法進行蛋白定量。樣品變性后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量蛋白，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶4 ℃下封閉1 h，TBST 洗膜5 min，共3次，加入ZO-1 抗體（1∶1 000）、E-cadherin抗體（1∶1 000）、FSP1抗體（1∶1 000）、Notch3 抗體（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜5 min，共3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔的二抗（1∶1 000），37 ℃下孵育1 h，TBST 洗膜5 min，共5 次。顯影曝光，利用Image-Pro Plus圖像分析系統分析蛋白條帶的灰度值。重復3次，取平均值。

CCK-8 法檢測EGCG 對HPMCs 的細胞毒性：收集HMrSV5，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基稀釋成單細胞懸液，以3×104/mL密度接種于96孔板，接種體積為200 μL。EGCG 溶于DMEM 完全培養基中，分別采用0，20，40，60，80，100 μg/ mL EGCG 處理各組細胞，在細胞培養箱中培養24 h 后加入20 μL CCK-8 檢測試劑，1 h后用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度。

細胞轉染：將HMrSV5 細胞分為si-NC+EGCG 組和si-Notch3+EGCG組，按美國Invitrogen 公司Lipofectamine 2000 說明書步驟進行轉染。調整HPMCs 數量，接種于6 孔板，使用不含抗菌藥物的完全培養基培養，使轉染時細胞生長密度達70%。制備Notch3 特異性si-RNA（si-Notch3）與脂質體復合物，同時制備無干擾作用的si-RNA（si-Control）與脂質體復合物，將復合物加入6 孔板相應si-Notch3+EGCG 組和si-NC+EGCG 組的孔內，搖動、混勻，6 h 后棄去細胞培養基，用PBS 洗滌細胞2次，更換為DMEM 完全培養基，24 h 后更換為含有抗菌藥物的完全培養基。采用qRT-PCR 法檢測轉染后細胞中Notch3的表達。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7.0 統計學軟件分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

注：a組為新開管PD患者組，b組為PD 1年以上患者組。與a組比較，*P ＜0.05。圖5同。A.qRT-PCR法檢測ZO-1，E-cadherin，FSP1 mRNA表達水平 B.Western blot法檢測ZO-1，E-cadherin，FSP1 蛋白表達水平圖1 新開管PD和PD 1年以上患者HPMCs中ZO-1，E-cadherin，FSP1的mRNA和蛋白表達水平比較Note：Group a refers to the group starting PD，and group b refers to the group underwent PD for more than one year.Compared with those in the group a，*P ＜0.05（for Fig.1 and Fig.5）.A.Expression levels of ZO-1，E-cadherin and FSP1 mRNA（qRT-PCR）B.Expression levels of ZO-1，E-cadherin and FSP1 protein（Western blot）Fig.1 Comparison of expression levels of ZO-1，E-cadherin and FSP1 mRNA and protein of HPMCs in patients starting PD and underwent PD for more than one year

注：1組為正常HMrSV5，2組為200 μg/mL AGEs誘導HMrSV5，3組為500 μg/mL AGEs誘導HMrSV5。與1組比較，*P ＜0.05。A.qRT-PCR法檢測ZO-1，E-cadherin，FSP1 mRNA表達水平 B.Western blot法檢測ZO-1，E-cadherin，FSP1 蛋白表達水平圖2 不同質量濃度AGEs誘導HPMCs EMTNote：Group 1 refers to normal HMrSV5，group 2 refers to HMrSV5 induced by 200 μg/ mL AGEs，and group 3 refers to HMrSV5 induced by 500 μg/mL AGEs.Compared with those in the group 1，*P ＜0.05.A.Expression levels of ZO-1，E-cadherin and FSP1 mRNA（qRT-PCR）B.Expression levels of ZO-1，E-cadherin and FSP1 protein（Western blot）Fig.2 EMT of HPMCs induced by different mass concentrations of AGEs

2 結果

2.1 不同階段PD 患者HPMCs 中ZO-1，E-cadherin，FSP1 表達水平比較

qRT-PCR 法檢測結果顯示，與a 組比較，b 組患者的ZO-1 和E-cadherin mRNA 表達水平均顯著升高，FSP1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），詳見圖1 A。Western blot 法檢測結果顯示，與a 組比較，b 組患者的ZO-1 和E-cadherin 蛋白表達水平均升高，FSP1 蛋白表達水平降低，詳見圖1 B。結果表明，PD 1 年患者的HPMCs已向EMT轉化。

2.2 AGEs 誘導HPMCs EMT

qRT-PCR 法檢測結果顯示，與1 組比較，3 組患者的ZO-1和E-cadherin mRNA表達水平均顯著升高，FSP1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），詳見圖2 A。Western blot法檢測結果顯示，加入500 μg/mL AGEs誘導HMrSV5后，ZO-1 和E-cadherin 蛋白表達水平均升高，FSP1 蛋白表達水平降低，詳見圖2 B。結果表明，500 μg/ mL AGEs 可有效誘導HPMCs EMT，后續實驗可選擇此濃度構建EMT模型。

2.3 EGCG 對HPMCs 的細胞毒性

CCK-8法檢測結果顯示，與0 μg/mL比較，60，80，100 μg/mL EGCG 能顯著抑制細胞的活性（P＜0.05），詳見圖3。故選擇40 μg/mL 為EGCG給藥濃度。

2.4 Notch3 在EGCG 治療HPMCs EMT 中的作用

注：與0 μg/mL比較，*P ＜0.05。圖3 不同質量濃度EGCG對HMrSV5的細胞毒性Note：Compared with those in the 0 μg/ mL，*P ＜0.05.Fig.3 Cytotoxicity of EGCG with different mass concentrations on HMrSV5

qRT-PCR法檢測結果顯示，與對照組比較，實驗組患者的ZO-1和E-cadherin mRNA 表達水平均顯著降低，FSP1和Notch3 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與si-NC+EGCG組比較，si-Notch3+EGCG組患者的ZO-1 和E-cadherin mRNA表達水平均顯著升高，FSP1和Notch3 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05），詳見圖4 A。Western blot 法檢測結果顯示，與對照組比較，實驗組患者的ZO-1 和E-cadherin 蛋白表達水平均降低，FSP1和Notch3蛋白表達水平均升高；與si-NC+EGCG 組比較，si-Notch3+EGCG 組患者的ZO-1 和E-cadherin 蛋白表達水平均升高，FSP1 和Notch3 蛋白表達水平均降低，詳見圖4 B。

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與si-NC+EGCG組比較，#P ＜0.05。A.qRT-PCR法檢測 B.Western blot法檢測圖4 Notch3對經EGCG干預的HPMCs中ZO-1，E-cadherin，FSP1 mRNA和蛋白表達水平的影響Note：Compared with those in the control group，*P ＜0.05；Compared with those in the si-NC+EGCG group，#P ＜0.05.A.Results of detection（qRT-PCR）B.Results of detection（Western blot）Fig.4 Effect of Notch3 on the expression levels of ZO-1，E-cadherin，FSP1 mRNA and protein in HPMCs after the intervention of EGCG

A.qRT-PCR法檢測Notch3 mRNA表達水平 B.PD患者中Notch3與ZO-1，E-cadherin，FSP1相關性分析圖5 PD患者HPMCs中Notch3與ZO-1，E-cadherin，FSP1表達水平相關性分析A.Expression level of Notch3 mRNA（qRT-PCR）B.Correlation analysis of Notch3 with ZO-1，E-cadherin and FSP1 in patients underwent PDFig.5 Correlation analysis of Notch3 with ZO-1，E-cadherin and FSP1 expression levels of HPMCs in patients underwnet PD

2.5 PD 患者HPMCs 中Notch3 與EMT 基因表達水平相關性

采用qRT-PCR 法檢測PD 患者HPMCs 中Notch3 mRNA 表達水平，結果顯示，與a 組比較，b 組患者Notch3 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），詳見圖5 A。Notch3表達水平與上皮分子標志物（ZO-1和E-cadherin）及間質分子標志物（FSP1）相關性分析結果顯示，PD 患者HPMCs 中Notch3 與ZO-1，E-cadherin 的表達水平呈負相關（r=-0.847 7，-0.382 2，P＜0.05），與FSP1的表達水平呈正相關（r=0.662 6，P＜0.05），詳見圖5 B。

3 討論

我國慢性腎臟病發病率為10.8%［10］，部分患者進展至終末期腎病，PD 已成為終末期腎病患者腎臟替代療法的重要選擇之一，但PD液的低pH、高葡萄糖、乳酸和葡萄糖降解產物會引起HPMCs 的慢性炎癥和損傷，導致腹膜纖維化而致PD 失敗［11］。EMT 是HPMCs 腹膜纖維化的核心機制。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程［12］，在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移等多種纖維化疾病中起重要作用，主要特征為細胞黏附分子如E-cadherin表達下調、細胞角蛋白轉化為波形蛋白細胞骨架，且形態學上具有外間充質細胞特點等［13］。

研究顯示，高滲透壓、高糖及各種細胞因子等刺激均可促進HPMCs EMT，使腹膜間皮細胞失去細胞極性和喪失黏附性，E-cadherin表達水平降低，向成纖維細胞轉化，遷移和侵襲能力增強，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和波形蛋白過度表達等，HPMCs EMT 是腹膜纖維化的起始及關鍵環節，且與腹膜功能密切相關［14］。因此，抑制HPMCs EMT 對治療PD 具有重要意義。本研究中發現，相比于新開管的PD 患者，PD 1 年以上患者HPMCs 的ZO-1 和E-cadherin 表達水平均顯著升高，FSP1 表達水平顯著降低，表明HPMCs 已向EMT 轉化。AGEs 能引起體外培養的HPMCs 形態逐漸變為梭形，上調HPMCs的α-SMA 表達，下調E-cadherin 表達，從而誘導HPMCs上皮-間葉轉化［15］。考慮到原代HPMCs難以轉染等因素，本研究中采用HPMCs 細胞系HMrSV5 進行體外實驗研究。結果顯示，500 μg/mL AGEs 可顯著上調HMrSV5 細胞ZO-1 和E-cadherin 表達，顯著下調FSP1表達。故選擇500 μg/mL AGEs 作為造模劑量。綠茶提取物EGCG 具有很強的生物活性和抗腎癌作用，能抑制腎癌細胞生長，縮小新生微血管面積［16］。在非酒精性脂肪性肝病模型小鼠中，EGCG 治療使肝纖維化相關基因顯著下調，促進脂質和糖代謝、抗脂質過氧化和抗炎活性、抗纖維化，從而減緩非酒精性脂肪性肝病的進展［17］。本研究中，EGCG 可顯著減弱AGEs 對ZO-1，E-cadherin，FSP1表達的影響，表明EGCG可抑制AGEs誘導的HPMCs EMT；通過抑制E-cadherin 和波形蛋白的表達來抑制甲狀腺癌細胞的EMT、侵襲和遷移，這可能通過調節TGF-β/ Smad 信號通路實現［18］。此外，EGCG 預防腎小管細胞EMT 的分子機制很可能是通過激活轉錄因子核因子E2相關因子2（Nrf2）信號傳導和增加過氧化氫酶抗氧化酶來減少細胞內ROS 的產生［19］，但EGCG影響HPMCs EMT的具體作用機制仍不明確。

Notch3 是Notch 信號通路中的關鍵受體，可影響細胞的增殖、分化、遷移、生長、凋亡等過程。研究發現，賴氨酸特異性去甲基化酶1通過Jagged-1/Notch信號通路誘導EMT 并促進腎纖維化［20］。MATSUURA 等［21］研究發現，Notch3 可能通過調節EMT 來控制食管鱗狀細胞癌的化療敏感性。故本研究中重點關注Notch3 在EGCG 治療HPMCs EMT 中的作用。結果顯示，EGCG 可上調HPMCs 中Notch3 的表達，抑制Notch3 表達可減弱EGCG 對HPMCs 中ZO-1 和E-cadherin 表達上調及FSP1 表達下調的作用，表明EGCG 對HPMCs EMT 影響與調節Notch3 表達有關。LIN 等［22］研究發現，Notch3 的表達與GATA 結合蛋白3（GATA-3）的表達呈正相關，Notch3胞內結構域的過表達可能通過激活GATA-3轉錄來抑制EMT 的發展。另有研究表明，Notch3 胞內結構域可激活雌激素受體α（ERα）的表達，抑制乳腺癌細胞的EMT 表型［21］。本研究中發現，PD 患者HPMCs 中Notch3 與上皮分子標志（ZO-1 和E-cadherin）表達呈負相關，與間皮分子標志物（FSP1）表達呈正相關，表明Notch3在PD患者HPMCs EMT中發揮重要作用。

綜上所述，EGCG 可抑制HPMCs EMT，其作用機制與調節Notch3 表達有關。初步明確EGCG 對HPMCs EMT 的治療作用，可為進一步研究EGCG 對腎臟疾病的治療提供參考。