小兒黃龍顆粒治療注意缺陷多動障礙的網絡藥理學和分子對接研究

韋春香，鄭義翔，周雪，刁俊林△

（1.重慶市精神衛生中心，重慶 401147；2.西南大學醫學研究院，重慶 400715）

注意缺陷多動障礙（ADHD）是一種以多動、沖動和注意力缺陷為特征的神經發育障礙，屬中醫心肝系疾病范疇，多發于兒童［1］，超過2/3 患兒的癥狀會持續至成年期，導致嚴重的終身損害［2］。ADHD 發病機制復雜，目前主要采用藥物治療。西藥有哌甲酯和托莫西汀［3］，但會引起頭痛、失眠等藥品不良反應，患者依從性較低。中藥小兒黃龍顆粒具有滋陰潛陽、安神定志功效，能改善ADHD 患兒的多動不寧、神思渙散、多言多語、性急易怒等癥狀，安全性和有效性均較好［4］。本研究中采用網絡藥理學方法分析了小兒黃龍顆粒的活性成分，并預測治療ADHD 的潛在作用靶點和作用機制，為其臨床研究提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點預測

在TCMSP 數據庫（http：// tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中，以“熟地黃”“白芍”“知母”“五味子”“黨參”“石菖蒲”“桔梗”為關鍵詞檢索小兒黃龍顆粒的活性成分，并進行整合、去重；以化合物的口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為條件篩選有效成分，并結合已發表的文獻進行補充。在TCMSP 數據庫中檢索活性成分對應靶點，并通過UniProt 數據庫（https：// www.uniprot.org）規范靶點名稱。

1.2 靶點篩選

以“Attention deficit hyperactivity disorder”為關鍵詞，在DisGeNET 數據庫（https：// www.disgenet.org）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）、ADHDgene數據庫（http：//adhd.psych.ac.cn/）、TTD數據庫（https：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank數據庫（https：//go.drugbank.com）中檢索ADHD 的相關靶點，合并各數據庫靶點后去重，通過Uniprot 數據庫規范靶點名稱。通過Venny 2.1 平臺對小兒黃龍顆粒活性成分靶點與ADHD 靶點取交集，獲取共有靶點，即為小兒黃龍顆粒治療ADHD的潛在作用靶點；獲取共有靶點對應的活性成分，采用Cytoscape 3.8.0軟件構建小兒黃龍顆粒治療ADHD活性成分-共有靶點網絡，度值排名靠前的成分為小兒黃龍顆粒治療ADHD的關鍵成分。

1.3 潛在作用靶點蛋白互作網絡（PPI）構建

將共有靶點導入String數據庫（https：//www.stringdb.org）構建PPI，物種設置為“Homo sapiens”，靶點關聯置信度設置為0.40，其余參數為默認值，獲取蛋白互作信息［5］。采用Cytoscape 3.8.0 軟件生成PPI 中的核心靶點圖，采用該軟件中的CytoHubba 插件和Betweenness算法計算網絡的核心靶點。

1.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

利用Metascape數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html#/ main/ step1）對共有靶點進行GO 富集分析［生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）］及KEGG 通路富集分析。以P≤0.01 為篩選條件，采用R 4.0.2 軟件對lgP排名前20 的結果進行可視化處理，并繪圖呈現富集結果。

1.5 活性成分-靶點-通路網絡構建

將共有靶點、小兒黃龍顆粒活性成分及KEGG通路富集分析的相互作用信息合并，采用Cytoscape 3.8.0軟件構建活性成分-靶點-通路網絡，并通過節點度、中心度、緊密度等網絡拓撲參數分析靶點及活性成分。

1.6 分子對接驗證

以1.3 項下的核心靶點為受體，以其在1.2 項下小兒黃龍顆粒活性成分-共有靶點網絡中對應的關鍵成分為配體，進行分子對接驗證。通過RCSB PDB 數據庫（https：// www.rcsb.org）下載核心靶點的三維晶體結構，保存為pdb格式文件；采用PyMol 2.5.2軟件去除蛋白結構中的水分子和小分子配體，采用AutoDockTools 1.5.6 軟件進行加氫、去電荷等預處理，保存為pdbqt格式文件。通過TCMSP 數據庫下載活性成分的分子結構，保存為mol2格式文件，通過Open Babel 2.4.1軟件轉換為pdb格式文件；采用AutoDockTools 1.5.6軟件對活性成分配體進行能量最小化處理，賦予配體原子類型，計算電荷，保存為pdbqt 格式文件。運行AutoDockTools 1.5.6 軟件，采用遺傳算法進行分子對接操作，以結合能評估對接結果，結合能越低，表明配體與受體的結合力越強。結合能＜-4.25 kcal/mol，受體、配體間有一定的結合活性；結合能≤-5.0 kcal/ mol，二者間有較好的結合活性；結合能≤-7.0 kcal/ mol，二者間有較強的結合活性［6］。

2 結果

2.1 活性成分和靶點

共獲得47種活性成分（表1），合并其預測靶點并去除重復基因后，共獲得163個靶點。

表1 小兒黃龍顆粒中47種活性成分基本信息Tab.1 Information of 47 active components of Xiaoer Huanglong Granules

2.2 靶點構建與分析

在DrugBank，GeneCards，DisGeNET，TTD，ADHDgene數據庫中獲得ADHD疾病靶點個數分別為82個、1 890個（經篩選后為881 個）、24 個、40 個、359個，匯總并刪除重復靶點，最終獲得靶點1 115個。將小兒黃龍顆粒活性成分的163個靶點與ADHD的1 115個靶點導入Venny 2.1平臺，共獲得55 個共有靶點，即為小兒黃龍顆粒治療ADHD的關鍵靶點。詳見圖1。

圖1 小兒黃龍顆粒活性成分和ADHD交集靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of active components of Xiaoer Huanglong Granules and ADHD

在Cytoscope 3.8.0 軟件中構建的小兒黃龍顆粒活性成分-共有靶點網絡見圖2。網絡中，共101個節點和227條邊，根據度值篩選前5個成分分別為D（豆甾醇）、DS5（7-甲氧基-2-甲基異黃酮）、C（山柰酚）、BS4（β-谷甾醇）、A（木犀草素），這些成分可能是小兒黃龍顆粒治療ADHD的關鍵成分。

圖2 小兒黃龍顆粒治療ADHD活性成分-共有靶點網絡Fig.2 Network of active components-common targets of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.3 潛在作用靶點的PPI

將55個共有靶點導入String數據庫，獲取網絡信息后，采用Cytoscape 3.8.0 軟件構建PPI（圖3），該網絡包括55 個節點和311 條邊，顏色由紅到藍代表靶點在PPI中的相互作用由強到弱。利用Cytoscape 3.8.0 軟件中CytoHubba插件及Betweenness算法對網絡進行分析，獲取核心靶點（圖4）。結果表明，白細胞介素6（IL-6）、蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、溶質載體家族6 成員4（SLC6A4）、腎上腺素能受體β2（ADRβ2）和煙堿型膽堿受體α7（CHRNα7）6 個靶點在整個網絡中起關鍵作用，預測其為小兒黃龍顆粒治療ADHD 的核心靶點。

圖3 小兒黃龍顆粒治療ADHD潛在作用靶點的PPIFig.3 PPI network of potential targets of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

圖4 PPI中的核心靶點Fig.4 Core targets in PPI network

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

A.BP分析 B.CC分析 C.MF分析圖5 小兒黃龍顆粒治療ADHD的GO富集分析條形圖A.BP analysis B.CC analysis C.MF analysisFig.5 Bar chart of GO enrichment analysis of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

對55 個共有靶點進行GO 富集分析，將BP，CC，MF 分析結果繪制為條形圖（圖5），橫軸代表關鍵節點的數量，顏色由黃到紫代表lgP由大到小。結果顯示，小兒黃龍顆粒治療ADHD 主要涉及突觸傳遞、細胞對有機環狀化合物及含氮化合物的反應等BP，突觸后膜、樹突及膜筏等CC，神經遞質受體活性、G 蛋白偶聯胺受體活性及單加氧酶活性等MF。將KEGG 通路富集分析結果繪制為氣泡圖（圖6），橫軸代表富集在該通路的靶點占所有共有靶點的百分比，氣泡大小代表富集在該通路的靶點數量，顏色由紫到紅代表lgP由大到小。結果顯示，小兒黃龍顆粒治療ADHD 的關鍵通路包括神經活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/ 絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路、環磷酸鳥苷/蛋白激酶G（cGMP/PKG）信號通路及膽堿能突觸信號通路等。

圖6 小兒黃龍顆粒治療ADHD的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.5 活性成分-靶點-通路網絡

通過Cytoscape 3.8.0 軟件構建小兒黃龍顆粒活性成分-靶點-通路網絡（圖7），包括96個節點和384條邊。每種活性成分都對應多個靶點，體現了小兒黃龍顆粒多種成分通過多靶點、多通路發揮治療ADHD的作用。

圖7 小兒黃龍顆粒治療ADHD活性成分-靶點-通路網絡Fig.7 Network of active components-targets-pathways of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

2.6 分子對接

將2.3項下6個核心靶點IL-6，AKT1，ESR1，SLC6A4，ADRβ2，CHRNα7 與5 個關鍵成分豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素進行分子對接，最終獲得12 組受體-配體對接結果（表2）。結果顯示，關鍵成分與核心靶點的結合能均小于-4.25 kcal/ mol，其中小于-5.0 kcal/ mol 的組合共9 組（75.00%），提示所篩選的關鍵成分與核心靶點間具有較好的結合活性。木犀草素與IL-6（結合能-5.12 kcal/ mol）及β-谷甾醇與CHRNα7（結合能-5.84 kcal/mol）分子對接結果見圖8。

表2 小兒黃龍顆粒治療ADHD的關鍵成分與對應核心靶點的結合能Tab.2 Binding energy of key components of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD and corresponding core targets

A.木犀草素-IL-6 B.β-谷甾醇-CHRNα7圖8 小兒黃龍顆粒治療ADHD的分子對接結果A.Luteolin-IL-6 B.β-Sitosterol-CHRNα7Fig.8 Results of molecular docking of Xiaoer Huanglong Granules in the treatment of ADHD

3 討論

ADHD是因先天稟賦不足、后天調護不當導致的臟腑功能失常，其主要病變在心、肝、脾、腎［7］，故針對此病可按瀉實補虛、調和臟腑、平衡陰陽的基本原則辨證論治，中醫辨證以腎陰不足、肝陽偏亢癥（陰虛陽亢證）多見。小兒黃龍顆粒具有滋陰潛陽、安神定志功效，是中醫辨證治療ADHD的良藥。

目前，公認的ADHD 發病機制是兒茶酚胺類神經遞質去甲腎上腺素和多巴胺代謝障礙導致的腦功能輕度缺陷。小兒黃龍顆粒的有效成分山柰酚是一種天然的可食用黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山柰的根莖，廣泛存在于各種蔬菜和水果中，具有抗炎、抗氧化、抗缺血損傷、抗驚厥、抗抑郁、抗癡呆等多種神經系統作用［8］。動物體內研究顯示，山柰酚能通過提高線粒體和整個細胞質鈣離子水平來增加鈣離子單向轉運體的活性［9］，從而促進去甲腎上腺素和多巴胺的釋放［10］。β-谷甾醇能顯著增加小鼠大腦中去甲腎上腺素、5-羥色胺和代謝物5-羥基吲哚乙酸的水平［11］。KEGG 通路富集分析結果顯示，多巴胺與去甲腎上腺素受體相關基因大多富集在神經活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、cGMP/PKG 信號通路等。故山柰酚和β-谷甾醇可能通過影響兒茶酚胺類神經遞質水平及調控上述信號通路，發揮ADHD的治療作用。

研究表明，免疫系統可能參與包括ADHD 在內的各種發育障礙的發病機制［12］。既往研究顯示，ADHD 患兒血清中的IL-6 和腫瘤壞死因子（TNF）水平均明顯升高，且與兒童注意問題、違紀行為、攻擊行為等相關［13］。木犀草素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，可通過降低蛋白激酶C的活性及抑制鈣離子內流來阻止肥大細胞的活化，從而減少TNF-α、IL-6、白三烯的等炎性介質的釋放［14］，還可抑制小膠質細胞和星形膠質細胞釋放IL-6。KEGG通路富集分析結果顯示，木犀草素治療ADHD 的作用可能與白細胞介素17（IL-17）信號通路密切相關。

CHRNα7在大腦和外周廣泛表達，作為炎性反應的效應點，與迷走神經釋放的抗炎遞質乙酰膽堿結合，通過信號轉導抑制促炎因子的生成和釋放，在膽堿能抗炎途徑中起重要作用［15］。CHRNα7 對鈣離子具有高滲透性，不僅可作為離子通道，還可作為鈣活化信號通路的調節劑，在認知和免疫系統中具有多種重要作用，與ADHD 的發病機制密切相關［16］。豆甾醇是一種天然存在的植物激素，具有抗炎、抗氧化、降低膽固醇等作用［17］。YADAV 等［18］研究發現，豆甾醇能降低乙酰膽堿酯酶活性，明顯減輕由氯胺酮引起的小鼠自發活動、刻板行為等精神疾病癥狀。一項β-谷甾醇治療阿爾茨海默病的體內外研究結果顯示，β-谷甾醇對中樞乙酰膽堿酯酶有抑制作用，隨著治療的進展，β-谷甾醇組小鼠的工作記憶和運動協調能力均逐漸改善［19］。這可能是由于豆甾醇和β-谷甾醇降低乙酰膽堿酯酶活性，減少了對乙酰膽堿的降解，使CHRNα7 的抗炎作用更持久，以及間接激活鈣離子信號通路，從而共同發揮治療ADHD的作用。

雌激素信號通路在調節精神分裂癥的陽性癥狀、雙相情感障礙的躁狂癥及激素波動引起的認知和情緒中發揮重要作用。研究發現，雌激素受體ESR1 基因內的單核苷酸多態性與包括ADHD 在內的神經、精神疾病相關［20］。豆甾醇可通過激活ESR1 受體或N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體來增強膽堿能神經系統功能，從而發揮改善認知和學習記憶的作用［21］。β-谷甾醇也能通過與HT22 細胞的細胞膜結合，影響雌激素受體激活PI3K 信號通路，增加PI3K 活性，抑制葡萄糖氧化酶所誘導的氧化應激與脂質過氧化反應，進而改善腦代謝［22］。

綜上所述，小兒黃龍顆粒主要活性成分豆甾醇、山柰酚、木犀草素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、β-谷甾醇可能通過IL-6，ESR1，ALT，SLC6A4，ADRβ2，CHRNα7 6 個核心靶點作用于神經活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通路、PI3K/AKT信號通路、cGMPPKG 信號通路、膽堿能突觸信號通路治療ADHD，其過程可能涉及兒茶酚胺類遞質的代謝、免疫系統、抗炎途徑等生物學過程。