中成藥中沙門氏菌環介導等溫擴增快速檢測方法的建立及應用*

馮潤東，賈首前，王莉芳，楊曉莉，徐長根△，張鴻豪

（1.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065；2.國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065；3.陜西省藥品監督管理局，陜西 西安 710065）

沙門氏菌Salmonella為常見人畜共感染的革蘭陰性桿菌［1］。據統計，全世界每年因沙門氏菌感染而發病的人口達9 000萬，死亡15.5 萬［2］。沙門氏菌在自然界分布廣泛，且可在動植物體內定植，而中成藥大多由動植物加工炮制而成，且在大量丸散膏丹的方劑中常以原粉入藥，故中成藥中沙門氏菌的監測是藥品質量評價的重要指標。沙門氏菌的檢驗方法主要包括生理生化法、免疫學方法及分子生物學方法［3］。2020 年版《中國藥典》中，沙門氏菌的檢測仍采用傳統培養分離法［4］，操作簡單、成本低，但操作過程及檢測周期長，在快速、特異檢測方面具有一定局限性［5-6］。其他各種檢測方法靈敏、迅速，但需昂貴、龐大的儀器設備和復雜煩瑣的電泳過程等，在藥品檢測中的應用較少。環介導等溫擴增（LAMP）為一種新型恒溫核酸擴增技術［7］，其特點是針對靶基因的6 個區域設計4 條特異性引物，利用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在等溫條件下連續擴增，試驗過程快速、簡便，檢測結果特異性強、靈敏度高，已被廣泛應用于致病微生物的檢測，有關沙門氏菌的檢測方法也有研究。歐新華等［8］建立了基于LAMP 技術的沙門氏菌屬檢測方法，并經電泳法評價其效果。劉衛德等［9］建立了檢測中成藥中沙門氏菌的實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法。雖然采用的檢測方法多樣，但檢測效果不一，尤其是涉及中成藥中沙門氏菌LAMP檢測的實際應用報道較少。為探索分子生物學方法在中成藥沙門氏菌檢測中應用的可行性，本研究中基于LAMP 技術原理，以沙門氏菌4 個亞種毒理因子invA 基因作為檢測模板，并設計特異性引物，建立簡便、高效的中成藥沙門氏菌的特異性檢測方法，為快速檢測藥品中的沙門氏菌提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

ZHTY-50ES型振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；202-2A 型恒溫培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；Eppendorf Mini Spain 型離心機（德國艾本德股份公司）；StepOne Plus 型實時熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；MBE200A 型藍光切膠儀（蘇州宇恒生物科技有限公司）。

1.2 試藥

Bst DNA 聚合酶（批號為B110061），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/L，批號為B500056），均購自生工生物工程＜上海＞股份有限公司；MgSO4（100 mmol/L），50×LAMP 熒光染料，亞硒酸鹽煌綠增菌液，生化試劑，均購于西安晶博生物科技有限公司；9 批次待檢藥品均為市售，藥品信息見表1。

表1 待檢藥品信息Tab.1 Information of drugs to be detected

1.3 菌株

沙門氏菌屬：甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiA，乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiB，丙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiC，鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium，金黃色葡萄球菌Staphylo-coccus aureus，大腸桿菌Escherichia coli，產志賀氏毒素大腸埃希氏菌Shiga toxin-producingEscherichia coli（STEC），均購自北納生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 LAMP 引物設計及合成

選擇沙門氏菌invA 基因，根據GenBank 數據庫中提供的沙門氏菌特異基因組序列進行序列比對，尋找一段高度保守區作為擴增對象，通過Primer Exploer V5軟件設計3 組LAMP 引物，分別為正向外引物（F3）、反向外引物（B3），正向內引物（FIP）、反向內引物（BIP），正向環引物（LF）、反向環引物（LB）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 沙門氏菌invA基因的LAMP檢測用引物序列Tab.2 Primer sequences for LAMP detection of invA gene of Salmonella

2.2 細菌DNA 模板制備

取細菌培養物1 mL，置1.5 mL EP管中，以12 000 r/min的轉速離心5 min，收集菌液，棄上清液。加入100 μL DNA 提取液，混勻，金屬浴100 ℃加熱保溫10 min，以12 000 r/ min 的轉速離心5 min，將上清液轉移至另一EP管中，作為DNA模板，-20 ℃保存備用。

2.3 引物篩選

將上述合成的LAMP 引物按濃度比例F3-B3-LF-LB-FIP-BIP（1∶1∶2∶2∶4∶4）進行配制。以沙門氏菌基因組DNA 為模板，采用以下LAMP 反應體系及檢測條件進行擴增，篩選最佳引物組。

LAMP反應體系［10］（10μL）：取ddH2O2.8μL，LAMP緩沖液1μL，dNTPs（1.6 mmol/ L）1.4 μL，MgSO4（8 mmol/ L）0.6 μL，甜菜堿（1 mol/ L）2 μL，Bst DNA 酶（8 U/ μL）0.4 μL，染料（1.6 mmol/ L）0.4 μL，引物（10 μmol/ L）0.4 μL，制備預混合溶液。每個反應管加入9 μL 預混合溶液，再加入1 μL 供試品溶液及對照品溶液，并設空白對照。后續試驗溶液的配制同此。

LAMP 檢測條件：反應混合物在實時熒光定量PCR儀檢測系統進行LAMP 反應，反應溫度為65 ℃，反應時間為60 min。試驗結果以擴增曲線、產物電泳或在藍光切膠儀下以陽性和陰性對照為基準目測進行判定。

最優引物篩選：分別用3 組引物進行LAMP 擴增，反應產物在藍光切膠儀下以陽性和陰性對照為基準進行目測（圖1 A），結果陽性反應液為黃色，陰性反應液為橙色，該反應結果基于擴增反應的微量pH 變化進行檢測［10］。由反應產物電泳圖（圖1 B）可見，陽性對照泳道中出現特異性擴增產物，而陰性對照泳道中無條帶，表明invA 基因引物組2為最優引物。

M.Marker 1.陽性對照 2-8.陰性對照A.藍光燈下結果 B.瓊脂糖凝膠電泳結果圖1 invA基因引物組LAMP擴增特異性評價M.Marker 1.Positive control 2-8.Negative controlA.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.1 Evaluation of LAMP amplification specificity of invA gene primer groups

2.4 方法學考察

特異性試驗：為了驗證引物對沙門氏菌檢測的特異性，于37 ℃條件下培養后，用2.3 項下反應體系及檢測條件，以4株陽性對照沙門氏菌、3株非沙門氏菌細菌培養物獲得的DNA 為模板進行LAMP 擴增檢測，以不含DNA 模板的陰性質控品作為陰性對照，驗證引物特異性，重復試驗3 次。采用建立的沙門氏菌LAMP 檢測方法對7株細菌進行檢測，菌株來源見表3，特異性檢測結果見圖2。反應產物在藍光切膠儀下以陽性和陰性對照為基準進行目測，結果見圖2 A。可見，沙門氏菌屬的檢測結果中，陽性反應液為黃色（4 株沙門氏菌亞種均為陽性），陰性及空白對照反應液為橙色。由圖2 B 可見，1，2，3，4泳道中均出現特異性擴增產物，而5，6，7及無菌水（空白對照）泳道中均無擴增條帶，表明invA 基因引物特異性較好。

表3 試驗菌株來源Tab.3 Sources of test strains

1.甲型副傷寒沙門氏菌 2.乙型副傷寒沙門氏菌 3.丙型副傷寒沙門氏菌 4.鼠傷寒沙門氏菌 5.大腸桿菌 6.金黃色葡萄球菌 7.產志賀氏毒素大腸埃希氏菌 8.無菌水（空白對照）A.藍光燈下結果 B.瓊脂糖凝膠電泳結果圖2 沙門氏菌LAMP特異性試驗檢測結果1.Salmonella paratyphi A 2. Salmonella paratyphi B 3. Salmonella paratyphi C 4.Salmonella typhimurium 5.Escherichia coli 6.Staphylococcus aureus 7.Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）8.Sterile water（blank control）A.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.2 Results of LAMP specificity test of Salmonella

靈敏度試驗：取營養瓊脂平板上新鮮生長的沙門氏菌BNCC336664 單菌落接種于LB 肉湯中，以180 r/min的轉速離心5 min，37 ℃培養24 h后，吸取1 mL 菌懸液置9 mL 無菌生理鹽水中，依次稀釋，分別得濃度為101，102，103，104，105，106，107cfu/ mL 的7 份純菌稀釋液樣品。分別取上述7 份樣品制備對應的DNA 模板1 μL，采用2.3項下方法進行LAMP反應，每份樣品DNA 模板設3個平行試驗。沙門氏菌原菌液濃度為108cfu/mL，10 倍倍比稀釋后，模板量分別為3×107～3×100cfu/mL，陰性對照為超純水，對系列稀釋菌液進行LAMP 檢測。結果見圖3。可見，沙門氏菌以invA 基因引物進行LAMP擴增的檢測靈敏度可達3×101cfu/mL。

1.超純水（陰性對照）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mL圖3 沙門氏菌LAMP靈敏度試驗結果1.Ultra-pure water（negative control）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mLFig.3 Results of LAMP sensitivity test of Salmonella

基質檢測限確定：取亞硒酸鹽煌綠增菌液10 mL，置25 mL EP 管中，分別 按107，106，105，104，103，102，101cfu/mL 的濃度加入沙門氏菌液，混勻，以不含菌液的陰性增菌液作為陰性對照，分別取1 mL 菌液提取DNA，進行LAMP 擴增檢測。本研究中所建立的LAMP檢測限為100 cfu/ mL，檢測微量污染沙門氏菌的樣品需通過增菌達到更高的靈敏度。對細菌濃度為3×107，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102，3×101cfu/mL的模擬增菌液樣本進行LAMP 檢測，檢測結果見圖4。可見，在細菌濃度為3×102cfu/mL 時仍可擴增出特異性產物。

2.5 樣品檢測

2-7.模板量為3×107～3×102 cfu/mL圖4 基質中沙門氏菌LAMP檢測限測定結果2-7.Templates：3×107-3×102 cfu/mLFig.4 Results of limit of detection determination of LAMP of Salmonella in matrix

取1.2 項下待測藥品各10 g 或10 mL，置無菌錐形瓶中，加亞硒酸鹽煌綠增菌液至200 mL，作為供試品溶液；另加入1 mL低于103cfu/mL的沙門氏菌液，同法制備供試液，作為陽性對照溶液；于無菌錐形瓶中加入亞硒酸鹽煌綠增菌液至200 mL，作為陰性對照溶液。上述溶液分別置37 ℃、180 r/ min 恒溫培養箱中過夜培養12 h后，按2.2 項下方法提取基因組DNA，采用建立的LAMP 方法進行檢測，反應產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。可見，陽性對照溶液泳道有特異性擴增，所有供試品溶液和陰性對照溶液泳道均無特異性擴增，說明9批次樣品均未污染沙門氏菌。

M.Marker DL 2000 N，N'.陰性對照溶液 P.陽性對照溶液1.排毒養顏膠囊 2.川貝枇杷露 3.川貝枇杷膏 4.強力枇杷露 5-8.桑菊感冒片 9.黃連上清丸圖5 9批次中成藥沙門氏菌LAMP檢測結果M.Marker DL 2000 N，N'.Negative control P.Positive control 1.Paidu Yangyan Capsules 2.Chuanbei Pipa Syrup 3.Chuanbei Pipa Concentrated Decoction 4.Qiangli Pipa Syrup 5-8.Sangju Cold Tablets 9.Huanglian Shangqing PillsFig.5 Results of Salmonella detection by LAMP in nine batches of Chinese patent medicine

3 討論

基因的篩選是沙門氏菌檢測的關鍵步驟，invA 基因具有屬特異性，是沙門氏菌屬檢測的常用靶基因［11-12］。經生物信息學分析與綜合測試評估，invA 在沙門氏菌中的特異性能為97.6%～97.8%［13-14］，達到理想靶標檢測要求，故本研究中選用invA 基因進行特異性引物設計。

LAMP 檢測對于引物設計的要求較高，反應所需Bst DNA 聚合酶可在特定條件下將寡核苷酸隨機摻入有缺口的DNA 模板進行跨片段擴增［15］。另外，環引物的加入可加速LAMP 試驗［16］，但同時也增加了引物二聚體形成非特異性擴增的可能性，故引物設計不合理易出現假陽性現象。本研究中設計了3組沙門氏菌invA特異性基因，每組篩選6條引物，引物特異性良好，試驗過程中未出現假陽性現象。

本研究中以甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiA、乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiB、丙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiC、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium的invA 基因為檢測目標，經過引物設計、引物篩選、引物特異性試驗、靈敏度檢測、基質中檢測限測試及前增菌培養，成功構建了中成藥中4 個亞種沙門氏菌的LAMP 快速檢測方法，其最佳反應溫度為65 ℃，反應時間為60 min，方法靈敏度可達101cfu/mL。采用新建立的LAMP 方法測定了模擬樣本亞硒酸鹽煌綠增菌液中的沙門氏菌，其靈敏度與細菌直接提取DNA 進行LAMP 測定結果相同，且干擾較小。本試驗根據擴增曲線、產物電泳及熒光檢測判定LAMP 檢測結果，證明LAMP 快速檢測方法檢測沙門氏菌的特異性和靈敏度較好，4 株沙門氏菌擴增結果顯示均為陽性，其余3 種對照細菌擴增結果顯示均為陰性。本方法從DNA 提取開始，約1.5 h 即可完成試驗，大大減少了檢測周期。其擴增反應在65 ℃恒溫條件下即可完成，不需使用特殊的儀器設備，操作簡便，LAMP 技術在普通實驗室條件下即可實現［17］。采用LAMP 方法快速初檢后，初篩呈陽性的樣本再用常規培養法進行驗證，可縮短檢測周期，減少了工作量，有效降低了檢測成本。

本研究中建立的LAMP 快速檢測方法能在24 h 內完成中成藥中沙門氏菌的檢測，具有檢測時效短、特異性強、靈敏度高、不易交叉污染等優勢，成為《中國藥典》方法的有效補充。此外，本研究中建立的方法經適當調整后還可應用于中藥材、中藥飲片、保健食品等原料中沙門氏菌污染的監測工作，有較好的推廣應用前景。