鮮竹瀝氣相色譜特征圖譜建立及不同炮制方法質(zhì)量評價*

肖小武，劉靜佳，洪挺，付輝政，羅躍華，周志強△

（1.江西省藥品檢驗檢測研究院·江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心·國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西 南昌 330029；2.南昌理工學院，江西 南昌 330044）

鮮竹瀝為禾本科剛竹屬的數(shù)種竹子的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體，具有清熱化痰、鎮(zhèn)驚利竅功效，主要用于肺熱咳嗽痰多、壯熱煩渴、小兒痰熱驚風等，《本草衍義》稱之為痰家之圣劑［1］，主產(chǎn)于江西。截至2022年12 月31日，在國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站數(shù)據(jù)中庫查詢到鮮竹瀝單方及復方制劑批準文號43個。其中，鮮竹瀝單方制劑文號24個；鮮竹瀝復方制劑文號有19個，涉及全國多地區(qū)的多家生產(chǎn)企業(yè)。鮮竹瀝現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于1992年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準 中藥材（第一冊）》，質(zhì)量標準僅有性狀、酪氨酸薄層色譜鑒別及pH 值、總固體、相對密度檢查項，不足以全面反映鮮竹瀝質(zhì)量的優(yōu)劣。鮮竹瀝的炮制方法包括傳統(tǒng)的直火燒制法、模仿倒懸炭火逼干餾法、直接水煮法、水蒸氣蒸餾法等。炮制方法及生產(chǎn)工藝不同，造成不同廠家和同一廠家、不同批次樣品的質(zhì)量存在差異。中藥特征圖譜是一種綜合、可量化的鑒定手段，主要用于評價中藥材及其制劑質(zhì)量的真實性、穩(wěn)定性、一致性等，中藥特征圖譜能全面反映中藥化學成分的種類和數(shù)量，進行整體質(zhì)量控制、評價和描述［2-3］。鮮竹瀝主要含有酚類、木質(zhì)素、氨基酸等成分［4-5］，且酚類成分為藥效成分［6-8］。目前，主要集中在單組分酚類、糖、氨基酸等成分的含量測定，未見鮮竹瀝特征圖譜的相關(guān)研究報道［9-12］。為此，本研究中在前期研究基礎(chǔ)上［13-14］建立了鮮竹瀝的氣相色譜（GC）法特征圖譜的檢測方法，并用于評價不同炮制方法鮮竹瀝的質(zhì)量，以全面控制和評價鮮竹瀝的質(zhì)量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890B型氣相色譜儀（美國Agilent公司），配有氫火焰離子化檢測器（FID），7693型液體自動進樣器，Openlab色譜工作站；BT25S型電子天平（瑞士賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Milli-Q 型超純水儀（美國Milli-pore公司）。

1.2 試藥

愈創(chuàng)木酚對照品（批號為111510-200202，純度為100.0%），4-甲基愈創(chuàng)木酚對照品（批號為AL190815-27，純度為99.98%），苯酚對照品（批號為G181013-04，純度為99.61%），甲基苯酚對照品（批號為G201021-05，純度為99.34%），乙基苯酚對照品（批號為G191026-03，純度為99.41%），6-甲氧基愈創(chuàng)木酚對照品（批號為MA190816-07，純度為99.08%），均購于中國食品藥品檢定研究院；鮮竹瀝共19 批（編號為S1-S19），分別來自江西省的上饒、九江、宜春及湖南省的懷化等，竹子基原均經(jīng)江西省林業(yè)科學院竹類研究所余林副研究員鑒定為正品，樣品信息見表1。

表1 鮮竹瀝樣品信息Tab.1 Information of fresh bamboo sap samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；初始溫度：75 ℃；程序升溫：以5 ℃/ min 的速率升至150 ℃、保持0.5 min，再以3 ℃/min的速率升至210 ℃、保持0.5 min；載氣：99.999%N2；柱流速：3.5 mL/min；進樣口溫度：260 ℃；FID 溫度：300 ℃；進樣量：1 μL；分流比：50∶1。

2.2 溶液制備

取6-甲氧基愈創(chuàng)木酚對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL 的溶液，即得對照品溶液。精密量取鮮竹瀝30 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，低溫旋干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號為S1），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以7號峰6-甲氧基愈創(chuàng)木酚為參照峰，計算各特征峰與參照峰相對保留時間的RSD。結(jié)果13 個共有特征峰相對保留時間的RSD≤0.01%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1），按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以7 號峰6-甲氧基愈創(chuàng)木酚為參照峰，計算各特征峰與參照峰相對保留時間的RSD。結(jié)果13 個共有特征峰相對保留時間的RSD≤0.02%（n=6），峰面積的RSD≤1.5%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取（編號為S1）樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以7號峰6-甲氧基愈創(chuàng)木酚為參照峰，計算各特征峰與參照峰相對保留時間的RSD。結(jié)果13 個共有特征峰相對保留時間的RSD≤0.02%（n=6），峰面積的RSD≤2.5%（n=6），表明方法重復性良好。

耐用性試驗：取樣品（編號為S1），按2.2 項下方法制備供試品溶液，選擇不同色譜柱（DB-WAX柱、HPINNOWAX柱，SH-Rtx-WAX 柱）考察方法耐用性，均以7 號峰6-甲氧基愈創(chuàng)木酚為參照峰，計算各特征峰與參照峰相對保留時間的RSD。結(jié)果13 個共有特征峰相對保留時間的RSD≤0.5%，峰面積的RSD≤2.0%，表明方法耐用性良好。

2.4 對照特征圖譜建立

取19 批（編號為S1-S19）樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，得19批樣品的色譜圖。可見，直火燒制法和干餾法的樣品（編號為S1-S13）有共有色譜峰，而水煮法和水蒸氣蒸餾法的樣品（編號為S14-S19）除溶劑峰外無其他色譜峰。4種炮制方法的典型色譜圖見圖1。分別將樣品（編號為S1-S13）色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版，剪切0～2 min 的溶劑峰，對14 個共有峰進行多點校正，采用Mark 峰匹配，對照特征圖譜疊加指紋圖譜見圖2。采用中藥色譜指紋圖譜相識度評價2012 版軟件對有共有峰的13 批（編號為S1-S12）樣品的特征圖譜進行比較，確定共有特征峰。生成14 個共有峰構(gòu)成的對照特征圖譜，其中7 號峰6-甲氧基愈創(chuàng)木酚為參照峰，詳見圖3。

圖1 4種炮制方法的典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of fresh bamboo sap prepared by the four processing methods

圖2 13批鮮竹瀝對照特征圖譜疊加指紋圖譜Fig.2 Reference characteristic chromatogram superimposed fingerprint of 13 batches of fresh bamboo sap

圖3 對照特征圖譜Fig.3 Reference characteristic chromatogram

2.5 特征圖譜色譜峰確認

取愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、甲基苯酚、乙基苯酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚對照品各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以保留時間對供試品溶液色譜圖的主要色譜峰進行指認，結(jié)果見圖4。其中，4 號峰為愈創(chuàng)木酚，5 號峰為4-甲基愈創(chuàng)木酚，6 號峰為苯酚，7 號峰為6-甲氧基愈創(chuàng)木酚，8 號峰為對甲基苯酚，9號峰為對乙基苯酚。

2.6 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相識度評價系統(tǒng)2012版軟件對13 批樣品（編號為S1-S13）的特征圖譜與生成的對照特征圖譜的相似度進行評價，結(jié)果相似度均大于0.990；而水煮法和水蒸氣蒸餾法的樣品（編號為S14-S19）除溶劑峰外無其他色譜峰，故無法計算相似度。結(jié)果見表2。

表2 氣相色譜特征圖譜相似度評價結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation of GC characteristic chromatogram

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

4.愈創(chuàng)木酚 5.4-甲基愈創(chuàng)木酚 6.苯酚 7.6-甲氧基愈創(chuàng)木酚 8.對甲基苯酚 9.對乙基苯酚圖4 對照特征圖譜色譜峰指認結(jié)果4.Guaiacol 5.4-Methylguaiacol 6.Phenol 7.6-Methoxy-guaiacol 8.4-Methylphenol 9.4-EthylphenolFig.4 Identification of chromatographic peaks of reference characteristic chromatogram

曾考察水飽和正丁醇、乙酸乙酯、乙醚3 種試劑作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，用水飽和的正丁醇提取時的色譜峰明顯少于乙酸乙酯和乙醚，不利于樣品整體情況的表征，而用乙酸乙酯和乙醚提取時的色譜峰數(shù)量相當，考慮到乙醚試劑的安全性及管控性。最終選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

3.2 色譜柱選擇

曾考察HP-5 弱極性柱、DB-17 中等極性柱、DB-WAX 強極性柱規(guī)格相同但固定相不同的毛細管色譜柱。結(jié)果HP-5 柱存在分離效果不佳，DB-WAX 柱因?qū)Ψ治鑫锏纳V吸附能力強，導致大部分色譜峰都集中在25～30 min 保留時間處出峰，綜合各色譜峰的分離度、保留時間分布分離度，最終選擇DB-WAX 柱。

3.3 升溫程序及分流比選擇

考察了多種色譜柱程序升溫及分流比，按擬訂色譜條件，各色譜峰分離均大于1.5，色譜峰峰形對稱且14 個共有特征峰保留時間分布較平均，其他條件下存在色譜峰分離度不達標或峰形不對稱等現(xiàn)象。

3.4 圖譜特征

目前，鮮竹瀝的生產(chǎn)工藝較粗放，且大部分工藝參數(shù)是通過人工控制或經(jīng)驗判斷，導致其特征峰峰面積相差較大。故建立了鮮竹瀝的特征圖譜進行質(zhì)量控制和評價。

3.5 方法評價

由圖2 可知，干餾法和直火燒制法均有14 個共有色譜峰，其中大部分指認為酚類成分，而水蒸氣蒸餾法和水煮法均不含上述酚類化合物。酚類成分是鮮竹瀝止咳化痰的有效成分。研究報道，禾本科植物竹子中含有大量木質(zhì)素［15］，且木質(zhì)素在高溫下裂解成苯酚類對羥基苯基（H）型、愈創(chuàng)木酚類的愈創(chuàng)木基（G）型、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚類紫香?。⊿）型及3-甲氧基鄰苯二酚類鄰苯二酚（C）型不同類型酚類成分［16-18］，上述酚類化合物跟特征圖譜指認峰的結(jié)構(gòu)相吻合?？梢姡苯訜品ㄅc干餾法均可將竹子中的木質(zhì)素裂解，而水煮法和水蒸氣蒸餾法的溫度達不到木質(zhì)素裂解成酚類化合物的溫度。按現(xiàn)行標準規(guī)定，鮮竹瀝為經(jīng)直接加熱自然瀝出的液體，故可認為水煮法和水蒸氣蒸餾法制備的非自然瀝出的液體為鮮竹瀝的非法制備工藝。建議采用特征圖譜對不同制備工藝制備的鮮竹瀝進行質(zhì)量評價，以及對非法工藝進行區(qū)分。