長鏈非編碼RNA TMEVPG1在原發性免疫性血小板減少癥患者預后評估中的價值

許建紅, 陳元鋒, 竺 青, 劉麗麗, 劉 虹, 譙銘銘

(山東省血液中心 機采科, 山東 濟南, 250014)

原發性免疫性血小板減少癥(ITP)又稱特發性血小板減少性紫癜，是一種免疫性出血性疾病，是由于病毒感染等因素使單核巨噬細胞系統遭到破壞，使得血小板減少而引發的疾病[1]。ITP臨床癥狀主要表現為皮膚出現出血點，大多數表現為皮膚黏膜出血，嚴重者可出現內臟、顱內出血，嚴重危及患者生命健康。目前，臨床通過使用糖皮質激素等藥物治療ITP, 但治療效果較差，故研究與ITP有關的標志物及其在患者預后評估中的價值至關重要[2-4]。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在免疫性疾病中具有重要功能[5-6], 其在細胞和體液免疫反應過程中發揮重要作用[7], TMEVPG1作為一種lncRNA, 主要在胸腺和脾臟中表達，與干擾素-γ(IFN-γ)的調節有關。研究[8]表明, ITP患者外周血單核細胞中lncRNA TMEVPG1呈低表達，并參與ITP的發生與發展。近年來，關于lncRNA TMEVPG1與ITP疾病關系的研究較少，因此本研究通過檢測lncRNA TMEVPG1在ITP患者中的表達變化，分析其在患者預后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月—2020年6月收治的126例ITP患者作為研究組，其中男66例，女60例，年齡30～35歲，平均(32.50±2.06)歲。根據《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016版)》[9]中治療12個月后預后情況，將ITP患者分為預后不良組31例(血小板計數<100×109/L, 伴有出血)和預后良好組95例(血小板計數≥100×109/L, 未出血)。另選取同期體檢的125例健康者作為對照組，其中男64例，女61例，年齡31～36歲，平均(33.50±2.33)歲。納入標準: ① 符合《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016版)》中關于ITP的診斷標準[9]者; ② 血常規檢查顯示血小板計數減少(至少2次檢查)者; ③ 所有ITP患者及其家屬均知情同意，并簽署知情同意書。排除標準: ① 其他繼發性血小板減少癥者; ② 合并心臟、肝臟等重要器官功能障礙者; ③ 存在精神疾病者; ④ 合并惡性腫瘤或其他內分泌疾病者; ⑤ 臨床資料不全者。研究經倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集: 收集所有受試者臨床資料，包括性別、年齡、體質量指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、紅細胞計數、血小板計數、IFN-γ、白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10。

1.2.2 樣品采集: ITP患者入院次日清晨和體檢者體檢當日采集外周血4 mL，將樣本置于EDTA抗凝管中，通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC), 低溫保存待測。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA TMEVPG1的表達水平: 取所有樣本，加入1 mL Trizol試劑(日本TaKaRa公司)提取總RNA, 采用Smartspec plus分光光度儀(美國Bio-Rad公司)測定RNA純度和濃度，將RNA反轉錄為cDNA, 采用qRT-PCR對lncRNA TMEVPG1進行擴增，引物序列見表1。lncRNA TMEVPG1反應條件為: 94 ℃, 5 min; 95 ℃, 15 s; 60 ℃, 30 s; 70 ℃, 30 s; 39個循環，以GAPDH作為內參。采用2-△△CT法分析lncRNA TMEVPG1的表達水平。lncRNA TMEVPG1、GAPDH引物序列由北京英格恩生物科技有限公司構建; 實時熒光定量PCR儀(型號ABI 7500)購自美國ABI公司。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 2組臨床資料比較

2組患者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、紅細胞計數等資料比較，差異無統計學意義(P>0.05); 研究組血小板計數、IL-4、IL-10低于對照組, IFN-γ、IL-2高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 2組臨床資料比較

2.2 2組lncRNA TMEVPG1水平比較

對照組lncRNA TMEVPG1表達水平為(1.03±0.05), 研究組lncRNA TMEVPG1表達水平為(0.57±0.07)。與對照組比較，研究組患者lncRNA TMEVPG1水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 不同預后ITP患者lncRNA TMEVPG1水平比較

預后不良組患者lncRNA TMEVPG1水平為(0.36±0.05), 低于預后良好組的(0.63±0.08), 差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 ITP患者lncRNA TMEVPG1與血小板計數、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的相關性

Pearson相關性分析結果顯示, lncRNA TMEVPG1與血小板計數、IL-10、IL-4呈正相關(r=0.729、0.382、0.227,P<0.05), 與IL-2、IFN-γ呈負相關(r=-0.252、-0.542,P<0.05), 見圖1。

2.5 COX回歸分析探討ITP預后不良的危險因素

將ITP患者預后作為因變量，以血小板計數、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、lncRNA TMEVPG1水平作為自變量，進行COX回歸分析，結果顯示lncRNA TMEVPG1水平降低是ITP患者預后不良的危險因素(P<0.05), 見表3。

表3 COX回歸分析影響ITP患者預后不良的危險因素

3 討 論

ITP是一種以血小板減少為特征的血液系統疾病，血小板減少極易引起皮膚黏膜出血、消化道出血，嚴重影響患者生活質量，甚至威脅患者生命健康。研究[10]報道, ITP具有較高的發生率。目前，臨床使用糖皮質激素、丙種球蛋白等藥物治療ITP, 雖然可快速緩解癥狀，但仍有部分患者病情復發，且長時間使用激素藥物可形成激素依賴，因此研究與ITP有關的標志物及其在患者預后評估中的價值至關重要[11-12]。

隨著對lncRNAs研究的深入，發現其在免疫性疾病的發生發展中具有重要作用[13]。IL-2、IFN-γ是Th1型細胞因子，具有促進炎癥的作用, lncRNA TMEVPG1位于含有IFN-γ基因的細胞因子基因簇中，與IFN-γ的調節有關[14]。研究[15]表明, lncRNA TMEVPG1在ITP中表達下調，推測lncRNA TMEVPG1可能通過正向調節炎癥反應抑制疾病的發生發展。lncRNA TMEVPG1異常表達與干燥綜合征患者自身抗體有關，其表達水平與Th1細胞的比例有關[16]。IL-4、IL-10是Th2型細胞因子，可抑制Th1型細胞因子引發的炎癥反應，具有抑制炎性反應的作用，臨床試驗[4, 17]結果證明IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10參與ITP自身免疫疾病的發展過程。lncRNA TMEVPG1因IFN-γ感染而在機體內表達失調，并參與抗病毒免疫反應[18-19]。王羨等[14]研究結果表明, lncRNA TMEVPG1在Th1細胞的IFN-γ表達中起作用，進而參與免疫性疾病的發生。本研究結果表明，與對照組比較，研究組患者lncRNA TMEVPG1水平降低，經Pearson相關性分析結果顯示, lncRNA TMEVPG1與血小板計數、IL-4、IL-10呈正相關，與IFN-γ、IL-2呈負相關，提示lncRNA TMEVPG1異常低表達可能與ITP的發生發展有關; 預后不良組患者lncRNA TMEVPG1水平明顯低于預后良好組，提示lncRNA TMEVPG1低表達患者預后不良; COX回歸分析表明, lncRNA TMEVPG1降低是ITP患者預后不良的獨立危險因素，提示lncRNA TMEVPG1可作為ITP患者預后評估的有效指標。

綜上所述, ITP患者lncRNA TMEVPG1水平降低與患者不良預后有關，可作為ITP患者預后評估的輔助指標。但本研究存在一定的不足，如樣本量少，只探討了lncRNA TMEVPG1在ITP患者中表達的變化，未闡明其在疾病中的具體作用機制，還需進一步深入研究。