非洲豬瘟血清學診斷技術研究進展

楊欽翔，鄒興啟，趙啟祖

(中國獸醫藥品監察所 國家/WOAH豬瘟參考實驗室，北京 100081)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種豬急性、熱性、廣泛出血傳染病，致死率高達100%[1]。該病現階段仍然缺乏有效的疫苗，主要通過監測、撲殺及加強生物安全管理等綜合措施來防控。診斷是防控該病的第一步，血清學診斷作為一種特異性、敏感性較強的診斷方法，在臨床使用上操作方便、成本低，發揮著不可取代的作用，常用方法如酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫過氧化物酶試驗(immunoperoxidase test,IPT)、免疫印跡試驗(immunobiotting test,IBT)以及免疫層析法(immunochromatographic assay, ICA)。本文對血清學診斷技術進行總結，為更好地了解ASFV結構，改進和研究新的血清學診斷方法提供思路。

1 ASF流行病學

ASF自1921年被發現以來，一直受各國養豬業的高度重視，世界動物衛生組織(WOAH)將ASF列為法定報告動物疫病，同時也是我國一類動物疫病。1921年ASF首次在肯尼亞爆發，開始呈現地方性流行。1957年，ASF傳到了葡萄牙，至此ASF在歐洲地區傳播，經30多年才得以消滅。2007年，ASF再次從格魯吉亞向周邊擴散蔓延，隨后逐年向外延伸，向西傳至歐洲腹地國家，向東至遠東地區，對周邊國家形成了嚴重的威脅[2]。

2018年8月，在沈陽發現中國首例ASF病例，隨后在中國各省市迅速蔓延。2018-2019年ASF主要分布在我國東北及中東部地區。得益于有效的防控措施，ASF疫情總體可控，呈現發散、減弱趨勢。2020年共報告19起，撲殺生豬1.35萬頭，2021年共報告14起，撲殺0.36萬頭，疫情形式總體逐漸平穩[3]。

我國自2018年首次報道ASF以來，全國均發生并流行ASF，造成了大量豬只死亡和重大經濟損失。初期，ASF急性發病，病程短，死亡率高，往往未產生抗體豬就死亡，主要采用熒光PCR等快速核酸檢測技術進行病原學診斷。2020年我國發現了低致死率ASFV基因Ⅱ型變異株以及基因Ⅰ型毒株[4-5]。國內ASF疫情流行發生重大變化，出現慢性隱性感染，傳染隱蔽性加強，防控難度加大。豬通常在感染后7～10天內產生針對ASFV的抗體，并持續很長一段時間。因此，對亞急性和隱性的ASF診斷可以進行特異性血清學檢測。

2 病毒結構

了解ASFV粒子的結構以及蛋白質的組成對于血清診斷有著免疫學意義，ASFV是一個大型的雙鏈DNA病毒，基因組全長為170～190 kb，可以分為24個基因型，根據基因型的不同有151～167個開放閱讀框(ORF)，編碼50多結構蛋白和100多種非結構蛋白[6-7]。ASFV粒子呈現二十面體形態，有囊膜[8]。病毒粒子由內到外主要由五個部分組成，分別是第一層病毒基因組(Genome)DNA的擬核、第二層內核芯殼(Core shell)、第三層內膜(Inner envelope)、第四層衣殼(Capsid)和第五層囊膜(External envelope)[9]。結構圖如圖1所示。

圖1 ASFV 顆粒圖示和每一層中的蛋白質[10]Fig 1 Illustration of ASFV particle and examples of proteins in each layer[10]

3 診斷靶標

對于血清學診斷，尋找具有良好反應原性的抗原是構建診斷方法的關鍵。Alejo等人使用蛋白質組學技術，質譜和免疫電子顯微鏡的方法建立具有Vero適應的ASFV的蛋白質抗原圖譜，總共鑒定68種病毒蛋白和44種未被識別的蛋白[11]。由B646L編碼p72蛋白是ASFV構成二十面體衣殼的主要結構蛋白，是ASFV晚期表達蛋白，分子質量在73.2 ku。p72是第一批被確定為在自然感染后誘導抗體的病毒蛋白之一[12]，具有很強的反應原性和免疫原性，也是病毒感染后血清中存在的主要抗體[13]。但部分ASFV毒株的p72基因在C末端不保守，所以以p72抗原開發血清學診斷方法時應該注意C末端的使用[14]。

p54蛋白是ASFV早期表達蛋白，編碼基因為E183L，位于病毒的內囊膜，其免疫原性好、結構保守。實驗中將重組蛋白克隆到pGEX中以大腸桿菌表達，用感染血清進行測試，重組p54的IgG和IgM抗體具有良好的反應性[15]。由于p54蛋白在感染后早期表達，并且血清中p54抗體可以長期存在，是血清學檢測的重要靶點。p54在不同地區毒株的氨基酸具有一定的差異，但也有研究表明p54作為血清學檢測靶點容易造成假陰性[16]。

p30蛋白也被命名為p32蛋白，編碼基因為CP204L，在感染后早期表達，可以誘導中和抗體的產生,并且和p54一樣在整個感染過程中都能被明顯的檢測[17]。ASF診斷國家標準國標GB/T18648-2020《非洲豬瘟診斷技術》推薦使用p30蛋白作為間接ELISA的檢測抗原[18]。

CD2v蛋白是由EP402R基因編碼，存在于病毒的囊膜上，與病毒毒力有關，也是病毒紅細胞吸附現象的關鍵蛋白質[19]，同時CD2v也介導ASFV血吸附的血清學特異性反應[20]。早期研究報道CD2v免疫原性較弱，但近期發現CD2v蛋白可以表現出很好的免疫原性[21]。所以CD2v也是ASF潛在的診斷靶點。

由于分子生物學的發展，近年來大家都以大腸桿菌表達系統表達重組抗原作為原材料進行血清學診斷試驗的開發，國外有使用病毒感染細胞直接包被抗原。對比重組蛋白來說，避開了操作ASFV活毒的風險，并且可以做到標準化，在不同實驗室獲取結果的一致性。其中Reis等人使用原核表達系統表達了血清學的12種目標蛋白(p54、K205R、A104、B602L、p72、p30、CP312R、NP419L、F334L、K196R、p10、C44L)，用ASFV分離株感染后的豬血清對重組蛋白進行酶聯吸附反應，在感染后第7天E183L/p54、K205R、A104R、CP204L/p30抗體水平升高，在感染后第14天敏感性達到100%；B602L、B646L/p72、CP312R、NP419L、F334L在感染后14天血清學反應升高，在第21天敏感性達到100%，并且抗體可以存在很長時間；其余蛋白K196R/胸苷激酶、K78R/p10和C44L在感染后未見明顯的血清學反應[15]。常見診斷標靶見表1。ASFV蛋白極性極強，對表達蛋白不做適宜的修飾很難表達成功，但修飾后表達蛋白可能與ASF陽性血清反應性變差，這也是ASFV重組蛋白作為診斷抗原的難點所在。

表1 ASFV常見診斷標靶Tab 1 Common diagnostic targets of African swine fever virus

4 血清學診斷方法

感染ASFV后，急性發作機體未產生抗體就死亡，但隨著病毒變異，亞急性或慢性感染的出現，病毒感染誘導體液反應，血液出現可檢測到的抗體水平。以下介紹幾種常用的血清學檢測方法。

4.1 ELISA ELISA反應是將已知的抗原或抗體結合在酶標板上，利用抗原抗體結合，通過酶標抗體進行標記，最后通過顯色物顯色，可用酶標儀或肉眼直接觀察，其顯色深淺與酶標抗體的含量成正比。ELISA一般分為間接ELISA，競爭ELISA和夾心ELISA。在特異性上夾心ELISA最高，而在敏感性上間接ELISA最高，但容易出現非特異性結合。在控制敏感性和特異性一直是建立ELISA檢測方法中重要的一環。我國農業農村部于2021年公布ASFV抗體檢測試劑盒名單，一共有26家企業的33個產品通過比對評價，其中間接ELISA試劑盒17個，阻斷ELSIA試劑盒12個，夾心ELSIA試劑盒4個。這些試劑盒多用p72、p30、p54的重組蛋白作為診斷靶標。其中個別企業以病毒MGFs和CD2v為診斷靶標建立ELSIA抗體檢測試劑盒[22]。

國外生產的ID-VET ELISA抗體檢測試劑盒是基于p72建立的[23]，同時INGENASA公司也基于p30、p54、p72多肽生產間接ELISA試劑盒[24]。INgezim PPA COMPAC ELISA試劑盒同樣以p72蛋白為包被物建立血清學檢測方法[25]。E. Nieto通過p30與p72蛋白建立間接ELISA檢測方法。

4.2 IFA與IPT 對于ASF陽性或者可疑確診的樣品，可進行IFA檢測。IFA與IPT試驗是基于對ASF特異性抗體進行檢測，這些抗體結合了被ASFV感染后固定的細胞，抗原抗體反應后對標記的熒光素蛋白或者過氧化物酶進行檢測，IFA試驗陽性樣本會在感染細胞中出現特異性的熒光，IPT試驗則是觀察細胞的特異性染色，IPT區別于IFA試驗是不需要熒光顯微鏡即可進行。IFA和IPT的特異性高于ELISA 檢測方法，常作為抗體檢測的金標準方法用于新建抗體檢測方法的驗證。此實驗需要高級生物安全實驗室操作病毒以及熒光顯微鏡，很難實現高通量，在臨床中使用并不廣泛。目前還沒有商品化的IFA試劑盒。

IPT技術是歐盟參考實驗室(National Reference Laboratories NRL)中選定的驗證性測試，它是一種應用于固定細胞的免疫-細胞技術，通過過氧化物酶的作用來確定抗體抗原復合物的形成。它具有很高的靈敏度，該方法還可以檢測多種種類的豬材料，如血液、滲出液組織或體液。Pastor等[26]在斑點免疫結合試驗(DIA)的基礎上，研制了一種硝酸纖維素試紙條檢測ASFV，將可溶性抗原吸附在試紙上，通過過氧化物酶結合檢測抗體，國內也有免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)的研究，與三種ELISA試劑盒(針對p54蛋白的ELISA方法、針對p30蛋白的iELISA和針對p72的阻斷ELISA)進行了對比，IPMA的符合率均在98%以上[27]。

4.3 IBT 對于針對ASF陽性或者可疑確診的樣品，進行IBT驗證試驗，其實驗步驟是病毒純化后進行SDS-PAGE電泳，通過電流將蛋白轉到硝化纖維素膜上，陽性血清與膜上的抗原蛋白(IP 12、IP 23、IP 25、IP 25.5、IP 30、IP 31、IP 34 和 IP 35)反應，通過染色判斷是否感染ASFV。膜上的蛋白質可以與急性期和恢復期豬血清發生反應，因為印跡條帶大小的不同這個方法在理論上可以做到區分ASF的感染早期或晚期，具有很好的臨床診斷應用前景。但該方法存在ASFV純化困難、免疫印跡技術重復性不佳等問題，在臨床上應用還需要進一步攻克難題。Kazakno[28]將p30蛋白與HIS標簽鏈接，層析純化得到了p30蛋白，在此基礎上建立了基于p30的ASF血清學診斷免疫印跡方法，避免了原核表達的重組蛋白不與血清反應的影響，敏感性和特異性都得到了顯著提升。

4.4 ICA 免疫層析法是將特定的抗體或抗原固定于載體的某一區帶，在一段加入血清后由于毛細管作用，待檢樣品移動到固有區域發生抗原抗體特異性結合。傳統免疫層析技術以膠體金為標記物，通過條帶顯色對目標物定性檢測或半定量分析。無需借助大型儀器，通過抗原抗體結合可以快速的實現檢測分析。由孟康等將p72蛋白噴涂在標記物墊上，制得的膠體金檢測試紙可快速地檢出血清中ASFV抗體[29]。Sastre[30]在層析技術基礎上研發抗原測定的側流分析(LFA)，使黑色乳膠珠值結合抗p72單克隆抗體，檢測血中的抗體，在10 min內得到檢測結果。在臨床進行ASFV檢測時，使用最廣泛和最成熟的免疫層析法為膠體金免疫層析試紙條，該方法操作簡單，結果迅速，但該方法的敏感性不足，容易造成假陽性。隨著新技術的發展，有研究使用截短的 p54 蛋白作為抗原，并將其與Eu摻雜的熒光微球作為示蹤劑結合，特異性檢測ASFV抗體[31]。由熒光微球標記的試紙條既保留膠體金快速的優點，也具有熒光素的高敏感性。

5 總結與展望

由于ASFV感染后抗體第1周產生并持續很長一段時間，因此血清學是診斷ASF的主要方法。我國從2018年傳入ASF至今，ASF臨床表現已由急性型臨床特征轉為亞急性型、低死亡率、臨床癥狀不明顯等弱毒株感染特征，由最初以qPCR技術為主的檢測ASF到現在血清學檢測抗體，血清學診斷應用逐步擴增。在ASF沒有可用的商品化疫苗的情況下，血清學檢測抗體陽性即表示著ASFV感染。

我國現階段多采用ELISA方法進行血清學的檢測，但由于ASFV結構復雜開放閱讀框多，靶向抗原的選擇以及重組蛋白的表達是ELISA方法建立的難點。WOAH建議在陽性ELISA的結果下需要通過其他方法確認，如IPT、IFA試驗。基于ASFV感染細胞的檢測方法，如IFA與IPT，對于診斷亞急性或隱匿型疾病非常有用，但涉及生物安全和標準化問題，很難在臨床上進行大批量應用。隨著ASF的大流行，迫切需要開發敏感性強、特異性高、適合于臨床診斷的快速檢測方法，如新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)免疫IgM/IgG 抗體檢測方法[32]，通過硒納米顆粒橫向流動可以方便、快速、靈敏地檢測人血清和血液中的抗SARS-CoV-2 IgM和IgG。隨著技術發展，相信會有更加可靠的技術和產品推動ASF的有效防控。