微小免疫磁珠法制備神經干細胞治療脊髓損傷的動物實驗研究

田振，吳文濤，陳錦鴻，婁朝暉

(鄭州大學第一附屬醫院 骨科，河南 鄭州 450000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)患者可出現神經功能障礙，喪失獨立性，出現呼吸衰竭甚至死亡。全球每年新增SCI患者約50萬例[1-2]。以往認為中樞神經系統是難以再生的，只有康復治療能在一定程度上緩解SCI癥狀。近年來，干細胞因其具有多能性、更新能力及富含營養因子等優勢[3]受到人們的關注。不同類型的干細胞已被廣泛應用于SCI的各項臨床試驗中[4-8]。神經干細胞(neural stem cell，NSC)作為SCI治療的移植種子細胞，其分離培養及規模化擴增一直是組織工程面臨的重要課題。在實驗方面，NSC的純度和活性對實驗結果的影響很大。在臨床治療方面，只有獲得純度較高的NSC，才能對NSC的功能開展更加廣泛的試驗研究。但不論是直接由動物臍血、人骨髓等途徑所誘導獲得的NSC，還是直接由胚胎及成熟動物腦組織中分離的NSC，其純度都較低[9-11]。免疫磁珠法通過磁珠與細胞表面的物質結合，使靶細胞或雜質細胞具有磁性，繼而在磁場的作用下對細胞進行篩選，實現純化富集的目的。這一技術如今已在細菌與分子生物學領域被廣泛使用，其純化和富集的作用也獲得了免疫熒光、PCR、FISH和FACS等分析方法的證明[12]。本研究通過微小免疫磁珠分離純化得到NSC，并將其移植到SCI的大鼠模型中，對純化效果和實驗結果進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器鄭州大學第一附屬醫院實驗動物中心提供10只孕齡為12～18 d的Wistar大鼠胎鼠，用于NSC的獲得；提供30只10周齡的Wister大鼠，體質量280～300 g，用于SCI模型的構建。每只大鼠被置于溫度和濕度控制的12 h光-暗循環環境中清潔級飼養。本研究中的外科手術和動物試驗操作，均遵守醫學院動物試驗倫理委員會的規定。本研究使用了DMEM/F12、B-27、胎牛血清(ThermoFisher)、堿性成纖維生長因子、表皮生長因子(Peprotech)、小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體、包被羊抗小鼠IgG的賽默飛微小免疫磁珠(直徑≤50 nm)、FITC標記的羊抗鼠IgG、Anti-GFAP、Anti-βⅢ-tubulin、NSC培養基(ThermoFisher)、微量注射器(Smiths Medical)、流式檢測儀(Thermofisher AttuneNxT)、倒置相差顯微鏡(DMIRE2型)和恒溫CO2培養箱(Thermofisher Midi40)。

1.2 獲取、培養原代NSC對10只Wister孕鼠實施吸入異氟烷麻醉后，將其固定在鋪有冰袋的解剖平臺上，從腹部正中切口取出胚胎，在立體顯微鏡下去除結締組織和微細血管，使用碎塊機將取出的腦組織碎成體積約為1 mm3的碎塊，并迅速收集于離心管中，在0 ℃以下的冰袋上使用D-Hanks液清洗 3次，然后將100 μL 0.25%的trypsin-EDTA和DNAase加入離心管中，于常溫下靜置20 min，加入胎牛血清終止消化，使組織穩定，用玻璃吸管重復輕柔敲打20次后，得到單細胞懸浮液。

1.3 NSC的體外純化將獲取的細胞懸液在體外進一步純化：將獲取的原代細胞培養液從400目篩網濾過，將細胞濃度調整為1×106mL-1后，在室溫下靜置30 min，待細胞濃度穩定后進行細胞活力測定。

1.4 NSC的磁化將預處理過的小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體的濃度調整為4 μg·mL-1，添加到獲取的單細胞懸浮液中，使用玻璃吸管攪拌混合均勻，在24 ℃下孵化30 min，用PBS液沖洗懸浮液2次，以去除未結合的單克隆抗體和單細胞，羊抗小鼠抗體包被的IgG免疫磁珠經PBS沖洗2次得到純化后的磁化磁珠。將純化后磁珠的濃度調整為20 μg·mL-1，加入小鼠抗大鼠nestin結合的細胞懸浮液中，用玻璃吸管輕輕攪拌均勻后，置于24 ℃下遮光靜置1 h使其充分結合。

1.5 磁化NSC的篩選與富集將磁化后的細胞懸液轉移至試管中，將試管固定于電磁場中，靜置30 min后將試管內的液體用玻璃吸管緩慢移出，此過程中盡量不觸碰試管管壁，避免吸附在試管壁的細胞脫落。然后使用PBS溶液沖洗試管壁2遍，將貼附在試管管壁上的細胞沖洗掉，至此獲得了純化后的NSC懸液。將細胞懸液置于離心機中 ，以600 r·min-1的速度離心，將上清液去除后加入NSC培養基，然后在37 ℃、5% CO2條件下靜置培養1 h。

1.6 Nestin陽性細胞分析將磁化和富集過的原代細胞置于50 mL的燒瓶中，通過細胞計數板計算細胞濃度，將細胞濃度調整為1×105mL-1，取200 μL細胞懸液，平均分為10份置入4 ℃的冰箱中靜置10 min，取25 μL已被FITC標記成功的IgG(0.1 mg·mL-1)加入每份懸浮液中，繼續靜置20 min后，使用PBS溶液洗滌2次。再取5 mL 10 g·L-1的多聚甲醛加入20 mL的PBS中，混合均勻后加入細胞懸液中。選取同類型的無關抗體取代單一抗(nestin抗體)設為對照。使用流式細胞儀分析標本。

1.7 誘導NSC分化及其鑒定將傳代培養的NSC解離成單細胞懸浮液，分為3份，接種于(細胞濃度為1×106L-1)共聚焦培養皿中，加入10 g·L-1的胎牛血清，在室溫下培育5 d。使用PBS清洗1遍后進行MBP、GFAP和βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色。將未經處理的單克隆抗體稀釋200倍后按同樣的染色方法進行培養、染色，在電子焦顯微鏡下觀察對比。

1.8 細胞活性的鑒定純化前后的所有細胞均用10 g·L-1的健那綠在30～40 ℃下染色，細胞質呈藍綠色即為陽性，純化前后分別計數100個細胞，對其活力進行判斷。細胞活力為健那綠陽性細胞數占100個細胞的百分比。

1.9 實驗分組及方法取30只健康的雌性大鼠隨機分為實驗組、空白對照組、培養液組。對大鼠實施吸入異氟醚進行麻醉誘導，麻醉后沿著背部的腰椎和胸椎表面剃毛，用碘伏清潔皮膚，在以T10為中心的棘突上進行中線切口，切口從尾端暴露到腰椎。將椎旁肌肉從脊柱抬高。使用微型器械將T10椎板切除，暴露底層脊髓。SCI操作：使用改良Allen SCI撞擊器，以10 g重的沖擊棒從25 mm的高度自由落體撞擊暴露的脊髓。操作完成后立即縫合上覆肌肉，用創口夾封閉皮膚。在麻醉恢復期間，大鼠被放置在溫度可控的房間里，直到體溫調節重新建立。待麻醉蘇醒后大鼠表現為雙下肢癱瘓則證明SCI模型構建成功，術后人為輔助大鼠排便、排尿。干細胞移植的時機對于受損脊髓功能的成功恢復非常重要。在SCI慢性期，損傷部位會逐步形成膠質瘢痕，不利于神經元軸突的再生。Okano等[13]報道NSC移植的最佳時機為SCI后1～2周。所以在大鼠SCI后14 d，對實驗組大鼠腰椎尾側椎板切開處注射含有5×105個NSC的4 μL培養液至SCI水平；對培養液組通過腰椎尾側椎板切開處注射4 μL培養液至SCI水平；對空白對照組通過腰椎尾側椎板切開處注射4 μL生理鹽水至SCI水平。注射裝置為微型操作器配套微量注射泵，在5 min內將液體緩慢注入。注射完成后，用2-0絲線縫合手術切口。

1.10 大鼠行為學觀察(1)運動能力。通過運動能力評定量表(Basso，Beattie，Bresnahan，BBB)[14-15]評估。術后10周連續觀察各組大鼠后肢運動功能，每周1次。大鼠被放在1個長100 cm、寬50 cm、高20 cm的紙盒中活動4 min，盡量減少外界因素對大鼠產生的影響。BBS總分0～9分，0分表示后肢運動功能完全喪失，9分表示后肢運動功能完全恢復正常。2名對實驗設計毫不知情觀察者分別獨立記錄功能評分。如果評分存在差異，經過分析討論后統一分數。(2)斜板實驗：術后每周將大鼠置于斜板上測試1次以評估大鼠的運動功能，連續10周，記錄大鼠在斜板上停留超過5 s的最大斜板傾斜角度，測試過程中要保證周圍環境完全安靜，避免大鼠受到外界刺激，影響實驗結果。

1.11 組織學觀察術后10周后，所有的運動分析已經完成，注射過量戊巴比妥鈉處死大鼠。沿著原切口切開，切取損傷部位脊髓組織，測量脊髓組織的直徑并記錄。將脊髓組織置入配好的組織固定液中，使細胞保持原有的組織結構。使用乙醇做脫水處理，脫水成功后加入二甲苯，取代脊髓組織中的乙醇，然后進行浸蠟、包埋、切片(8 μm厚)。使用蘇木精水溶液加酒精伊紅染色后，在倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 NSC的分離培養觀察Wister胎鼠大腦皮層組織細胞的體外生長情況，倒置相差顯微鏡下新接種細胞的細胞懸液折光性較強呈橢圓形；原代培養24 h后，大部分細胞在內鏡下貼壁，少量細胞懸浮為單細胞，折光性降低。48 h后細胞開始出現死亡，剩余細胞大多數聚集成大小不同的細胞簇并開始分裂(圖1A)；5 d后細胞分裂趨于穩定，隨著細胞的生長形成了大小不一的球狀細胞叢(5～10個細胞)，鏡下觀察其胞體比例較大，胞漿顏色較暗，胞質占比較小，形態規則，界限清晰，折光性較強，在光鏡下符合NSC的特征。原代克隆傳代后，細胞分裂生長能力較強，4～5 d后生長出體積大、數量多的二代克隆球(圖1B)。在實驗過程中發現原代細胞具備很強的分裂增殖能力，即使在連續分裂傳代20代以上，仍然保持著分裂增殖和克隆的能力，符合NSC的特征。不過在傳代次數達到30次以上后，細胞分裂增殖的速度下降，其原因有待研究。

A為經過體外培養48 h胎鼠大腦皮層細胞(×100)；B為經過體外培養7 d的胎鼠大腦皮層細胞(×100)；C為未進行磁珠分選的胎鼠大腦皮層細胞(×400)；D為進行磁珠分選后的胎鼠大腦皮層細胞(×400)。

2.2 nestin陽性細胞表達結果分析將純化后得到的細胞懸浮液經流式細胞儀測定，小鼠抗大鼠nestin表達陽性的細胞占所有樣本細胞的(90.5±2.5)%(圖2)。細胞活性測定出細胞活力為(96.3±1.8)%。上述分析的結果顯示微小免疫磁珠純化的NSC活性并未受到影響且純度較高，符合該實驗的基本要求。

2.3 NSC的誘導分化與鑒定免疫熒光檢測結果顯示GFAP反應陽性細胞占所有細胞的75%左右。電鏡下細胞質大而淡綠色，細胞壁有較多的突起，對比星型膠質細胞形態特點(圖3A)可知大部分NSC細胞具備分化為星型膠質細胞的能力；MBP反應陽性細胞僅占所有細胞的20%左右，其在電鏡下呈綠色，由此可知少數 NSC細胞分化為少突膠質細胞(圖3B)；電鏡下僅有3%的細胞呈紅色，這類細胞突起較少但較長，表明βtubulinⅢ 反應陽性細胞占所有細胞的3%左右，可以認為少量NSC已分化為神經元(圖3C、3D)。該分化和鑒定結果進一步證明了通過微小免疫磁珠法分離培養獲取的細胞是NSC，其具有一般NSC增殖和多向分化的能力。

圖3 免疫熒光鏡下觀察NSC的分化能力

2.4 組織學觀察術后10周取材，肉眼可見對照組損傷節段脊髓及其周圍組織破壞程度高于實驗組，空白對照組和培養液組肉眼下觀察無明顯區別。HE染色后于鏡下觀察：干細胞移植的實驗組鏡下可見有大量梭形細胞生長(見圖4B)、脊髓直徑大于對照組(見圖4A)；對照組(圖4C、4D)可見大量脊髓組織壞死，鏡下可見單核細胞浸潤，組織形態結構紊亂，組織壞死程度大于實驗組。

2.5 動物實驗觀察大鼠行為學檢測結果如下。(1)SCI模型構建14 d后3組大鼠的BBB評分符合SCI。實驗組28～70 d的BBB評分高于空白對照組、培養液組(P<0.05)。空白對照組和培養液組BBB評分全程組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖5)。(2)實驗組大鼠28～70 d在斜板上停留5 s的平均最大角度均大于空白對照組和培養液組(P<0.05)。空白對照組和培養液組大鼠 28～70 d在斜板上停留5 s的平均最大角度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

A、B為實驗組HE染色(光鏡，×400)；C、D為對照組HE染色(光鏡，×400)。

表1 斜板實驗數據

圖5 SCI后干細胞移植后的運動功能分析

3 討論

盡管對神經退行性病變和神經保護機制已經進行了幾十年的基礎和臨床研究，但目前SCI的預后仍然較差[15]。SCI的機制復雜，有研究表明組織炎癥和細胞凋亡是脊髓繼發性損傷的主要過程[16]。即使在原發創傷性損傷中存活下來的神經元也可能在隨后的繼發性損傷中死亡。這種二次損傷往往是導致不可逆損傷和功能喪失的主要原因。科學研究已經證實，使用干細胞用作種子細胞治療SCI時，可以通過抑制局部炎癥反應、促進分泌生長因子、改善局部微環境等途徑促進受損神經再生[17]。而大多數神經系統病變均與NSC數量及功能失調直接相關[18]。運用NSC移植治療SCI時，為了促進功能恢復，必須抑制炎癥反應、神經元凋亡和壞死，改善受損組織的微環境，以增強神經元的再生，促進軸突再生和重建[19]。為了闡明干細胞移植在治療SCI中的作用模式，研究者做出了大量的努力，并發表了多篇文獻[20-21]。移植細胞在SCI的不同階段發揮多種神經和血管保護作用已經得到證實。這些細胞不僅能重組神經網絡，還能減少局部和全身炎癥，支持軸突再生和突觸發芽，減少膠質瘢痕。其機制可細分為3種不同的機制：細胞替代、功能多能性和干細胞再生。細胞替代可通過將移植細胞分化為神經元或血管細胞，以促進組織和功能恢復[22]。功能多能性描述了移植細胞分泌各種營養因子，這些因子有助于改善神經損傷和促進神經回路的再生[23]。干細胞再生發生在脊髓中，移植細胞可激活宿主NSC的再生[24]。目前在SCI治療領域，干細胞移植治療可用于實現2個主要目標。(1)再生：尋求替代丟失或受損的神經元，并誘導軸突再生或可塑性。(2)修復：替代支持細胞，如少突膠質細胞，以誘導髓鞘形成和防止進行性髓鞘丟失，使內源性細胞免受進一步繼發性損傷[25]。近年來種種研究也表明，使用干細胞治療可以改善急性SCI[26-28]。Schira等[29]將不受限制的干細胞移植到胸水平的背側半切損傷附近，結果病變減輕，組織保留、軸突再生增強，運動功能改善。Shinozaki等[30]解釋了干細胞治療SCI的策略，一些動物研究和臨床研究證明了干細胞可以促進細胞再生和功能恢復[31]。這讓人們有理由認為干細胞移植在SCI治療領域存在廣泛前景。而進行干細胞移植治療的前提是獲得高度均一的NSC，這一直以來是細胞生物學研究的熱點和難點。

本研究采用間接陽性法純化NSC，利用抗原抗體特異性結合的生物原理和磁珠在磁場中受電磁力影響的物理原理，在不影響NSC活力與功能的前提下提高了NSC的提純率。與傳統免疫磁珠法制備NSC的方法不同，本實驗所使用的磁珠為微小磁珠(一般直徑≤30 nm)，其最為重要的特點是體積為普通磁珠的千分之一，對NSC功能的影響可以忽略不計，可直接用于實驗研究或臨床治療[32]，提高效率的同時降低了出現NSC污染的概率，解決了NSC移植治療SCI種子細胞獲取的問題。

本實驗充分利用微小免疫磁珠法制備的NSC的優點，將NSC直接移植到SCI的大鼠模型中，實驗組功能改善優于對照組，這為NSC移植治療SCI提供了實驗依據，也為移植治療SCI提供種子細胞獲取的方法。從組織學的角度分析，實驗組與對照組相比具有較多的梭形細胞，損傷恢復傾向較為明顯，組織結構也較為穩定，進一步證實了NSC移植用于治療SCI的可行性。然而，將干細胞成功移植到靶組織并發揮作用仍然具有很多挑戰。例如，細胞去分化、免疫排斥和腫瘤形成等尚未解決的問題，進一步限制了干細胞移植治療SCI的臨床應用[33-34]，這需要進一步深度研究。本實驗為運用微小免疫磁珠法制備的NSC用于實驗研究或移植治療提供了實驗依據，為后續SCI治療打下了基礎。