外泌體在肺腺癌早期診斷和治療中的應用進展

張永凱，李豪源，史文松

(1.新鄉醫學院三全學院 臨床醫學院，河南 新鄉 453003；2.鄭州大學第一附屬醫院 胸外科，河南 鄭州 450052；3.河南中醫藥大學第五臨床醫學院/河南中醫藥大學人民醫院/鄭州人民醫院 胸外科，河南 鄭州 450053)

近年來，由于環境污染加重等因素導致肺癌發病率不斷上升，已占據癌癥發病率的首位[1]，其從病理類型分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，而肺腺癌為NSCLC的一種，目前是發病率最高的類型[2]。由于肺腺癌多屬外周型肺癌，早期無特異臨床表現，多數患者在有明顯臨床癥狀后才到醫院就診，確診時大多已經處于肺腺癌中晚期，這也是其生存率較低的原因。只有早期發現、診斷并對早期肺腺癌進行治療才有希望提高肺腺癌患者的生存率。低劑量計算機斷層掃描應用于肺癌早期篩查降低了肺腺癌的病死率，但其具有滯后性的缺點[3]。組織活檢雖能夠用作肺腺癌的確診指標，但其不能反映腫瘤整體情況且為有創檢查導致患者依從性差和應用有限，因此亟待尋找一種新的檢測手段[4]。液體活檢是一種無創檢查，具有易獲取、無創傷、依從性好和能早期反映腫瘤的整體狀況等優勢。隨著研究的深入，發現液體活檢在腫瘤早期診斷方面有著較大的潛能，外泌體是液體活檢中的一種，因其獨特優勢而逐漸受到關注[5]。

外泌體通過參與細胞間的信息傳遞和控制信號通路基因的表達來調控肺腺癌的發生發展、轉移，對肺腺癌的發生發展有著重要作用。在肺腺癌的發病早期，機體的外泌體表達水平會發生一定程度的改變且其在綜合治療中也會隨著腫瘤負荷有所改變，因此在肺腺癌的早期診斷和療效評價中具有很重要的應用價值。本文就此做出綜述，期望相關學者對此有所認識。

1 外泌體概述

外泌體是由質膜和內體膜出芽而產生的直徑在30～100 nm的盤狀細胞外囊泡，廣泛分布于血液、唾液等體液中，體內多種細胞包括癌細胞在內皆可產生外泌體[6]。外泌體內包含多種多樣的信號分子，如核酸、蛋白質、脂類、氨基酸，上述物質可來源于不同的細胞，且具有特異性[7]。外泌體核酸又包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等分子[8]。已經明確的是，外泌體通過這些信號分子的傳遞來調控其他細胞，在一些生理及病理活動中發揮著非常重要的作用，如生長發育、免疫功能、腫瘤細胞轉移等[9]。

2 外泌體與腫瘤

外泌體可使正常細胞發生惡變并促使腫瘤細胞增殖、免疫逃逸、遷移等環節[10-13]。李丹等[14]在結直腸癌患者血清中發現外泌體circRASGRF2水平升高，接著通過受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析發現外泌體circRASGRF2在結直腸癌診治和預后評估方面有著巨大的潛在價值。將腦膠質瘤術后患者與腦外傷患者進行比較，發現前者腦脊液中外泌體miR-21水平高于后者，并與患者總生存時間的中位值呈負相關，可以作為腦膠質瘤術后療效評價和復發的指標[15]。由此可見，外泌體在不同腫瘤的發生發展、治療、療效評價中均扮演著重要的角色。

3 外泌體在肺腺癌早期診斷中的作用

近年來，隨著人們對肺部體檢的重視以及CT用于肺癌篩查，肺結節檢出率增高[16]，但肺結節良惡性鑒別是臨床難點，腫瘤性肺結節大多是早期肺腺癌，治療效果遠好于中晚期，因此在肺結節中鑒別出早期肺癌是至關重要的，目前臨床多根據影像學特征進行鑒別，誤診誤治和過度診治共存。單純依據影像學鑒別有一定程度誤差，與體液檢測結合或可使其鑒別能力有進一步提升，從而降低臨床誤診率。

體液外泌體中含有多種類型的信號分子，其用于肺腺癌早期診斷時不僅可以從多種信號分子維度進行檢測，還是一種非侵入式的診斷方法[17]。Zhu等[18]采用熒光共振能量轉移的方法從體液中的獲取外泌體，為外泌體用于腫瘤的診斷奠定了基礎。另外將外泌體中的信號分子進行聯合檢測可能成為一種新的方式。

3.1 外泌體核酸

3.1.1外泌體miRNA 如何有效獲取體內外泌體中的miRNA是開展外泌體診斷的前提。通過基于小扁豆凝集素磁珠的聚焦捕獲策略，可以從血清中分離聚焦的外泌體，并且通過進一步研究，其內的miRNA在進行肺腺癌早期診斷時表現優越[19]。蘇曉桉[20]通過對比分析1期肺腺癌患者與健康患者血漿外泌體中miR-17-5p、miR-100-3p、miR-30a-3p的水平發現肺腺癌觀察組的miR-17-5p表達相對高，而miR-100-3p表達相對低，且差異有統計學意義，進一步建立ROC曲線結果表明miR-17-5p、miR-100-3p用于診斷早期肺腺癌篩查的曲線下面積(area under the curve，AUC)值分別為0.870、0.777，而將miR-17-5p與miR-100-3p聯合進行診斷的AUC值可達0.905，優于單一外泌體診斷，可能作為早期肺腺癌診斷標志物。陶瑞[21]發現，血漿外泌體來源的miR-125b-5p、miR-1-3p、miR-218-5p、miR-99a-5p及miR-9-5p在鑒別孤立性肺結節的良惡性上表現優越，并且當miR-1-3p與miR-99a-5p聯合診斷時的靈敏度和特異度均可達到100%，可以輔助影像學檢查，進一步提升良惡性鑒別能力。肺腺癌與肺肉芽腫的影像學特征有相似之處，如果能有效地鑒別能大大降低臨床誤診率，研究通過對比肺腺癌與肺肉芽腫患者血清外泌體發現，miR-139-5p、miR-30a-3p、miR-378a、miR-502-5p、miR-17、miR-100、miR-151a-5p表達在肺腺癌患者中高于肺肉芽腫患者，但仍需更多的樣本進行驗證[22]。因此，外泌體miRNA在早期肺腺癌的診斷方面有著獨特的優勢和巨大的潛在價值。

3.1.2外泌體circRNA circRNA是具有高度穩定性和特異性的RNA，因此在腫瘤預測及治療靶點擁有較大的潛在價值[23]。Chen等[24]首次通過高通量測序技術發現肺腺癌患者血漿外泌體中circRNA表達存在差異性，且有潛在的circRNA-miRNA-mRNA相互影響。臨床常用腫瘤標志物如癌胚抗原(carcino embryonic antigen，CEA)升高可見于肺腺癌，但其用于早期肺腺癌鑒別時敏感度和特異度均較低。Zhou等[25]發現外泌體circRAPGEF5在肺腺癌患者血清中表達較高，并且通過miR-1236-3p/ZEB1軸參與了肺腺癌的增殖和轉移，進一步研究表明將外泌體circRAPGEF5與CEA聯合進行檢測診斷肺腺癌要優于單獨CEA檢測。Wang等[26]研究發現，circRNA-002178不但可在肺腺癌患者血漿外泌體中檢測到，并且在癌組織中的表達遠高于癌旁組織，可能作為肺腺癌早期診斷的生物標志物。因此，深入外泌體circRNA的差異表達機制，有利于在早期肺腺癌診斷中應用。

3.1.3外泌體lncRNA lncRNA可調控肺腺癌的發生發展。Shen等[27]利用磁珠來分離血清中上皮細胞黏附分子陽性的外泌體，發現外泌體lncRNA RP11-77G23.5不但在肺癌體內高表達，促進肺癌的發展，而且上皮細胞黏附分子特異性外泌體RP11-77G23.5還能區分肺腺癌和肺鱗癌亞型。目前對于lncRNA的研究還較少，需要更加深入的研究。

3.2 外泌體蛋白質外泌體中含有較為豐富的來自親代細胞的蛋白質，對外泌體蛋白質的檢測是極具價值的一種肺腺癌診斷途徑[28]。目前常采用的外泌體蛋白提取方式有2種，一是運用細胞外囊泡陣列中的抗體來捕捉肺癌外泌體，并用生物素偶聯的方法測量和觀測外泌體蛋白，驗證了外泌體蛋白可單獨作為肺癌的診斷方法[29]，二是使用超速離心法分離血清外泌體，進而用液相色譜-質譜聯用和生物信息學分析，不僅對于鑒定早期、晚期肺腺癌患者和健康對照者血清中表達改變的潛在外泌體蛋白有可觀的收效，也開辟了通過外泌體蛋白進行靶向治療的路徑[30]。部分肺結節常一步一步發展為中晚期肺癌，在肺結節中甄別出早期肺癌，進行早期治療是臨床上重要的工作[31]。鐘榮斌等[32]發現NSCLC患者與肺良性結節患者血漿外泌體中存在多種差異表達蛋白質分子，對于區分良性肺結節和NSCLC方面可能具有潛在的診斷價值。

綜上，外泌體miRNA、circRNA、lncRNA和蛋白質在早期肺腺癌的診斷以及鑒別診斷中有著巨大的潛在價值，有望成為臨床中早期肺腺癌的診斷生物標志物。

4 外泌體在肺腺癌治療中的應用價值

4.1 外泌體是治療肺腺癌的潛在靶點根據外泌體在肺腺癌中的調控機制，可將其作為治療的潛在靶點。Zhang等[33]通過將骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-506與肺腺癌細胞共培養，發現外泌體miR-506可以在基于順鉑的熱療情況下作用于ATAD2/PI3K/AKT信號通路來干預肺腺癌細胞的生存狀態，進一步的結果顯示miR-506通過下調ATAD2抑制PI3K/AKT信號通路，增強肺腺癌細胞對基于順鉑的熱療的敏感性，為肺腺癌的外泌體治療提供了潛在的治療靶點。鐵死亡是一種依賴于鐵離子和脂質過氧化物大量累積的細胞程序性死亡方式。肺腺癌患者血漿外泌體可以增加肺腺癌細胞circRNA 101093的表達，進而上調脂肪酸結合蛋白3的水平，幫助花生四烯酸、?；撬嵝纬蒒-花生四烯酰?；撬釓秃衔?，當此復合物抵擋花生四烯酸摻入質膜時，外泌體就會通過特異性地降低多不飽和脂肪酸脂質過氧化的水平來減少活性氧的形成而抑制鐵死亡，因此阻斷外泌體可能有助于未來的肺腺癌治療[34]。

4.2 外泌體可用作藥物載體精準殺傷癌細胞外泌體作為核酸載體的優勢在于具有良好的藥代動力學和免疫學特性，并且能夠穿透合成藥物載體難以穿透的生理屏障。細胞納米化的方法可能使外泌體成為一種通用的核酸載體用在轉錄操作的應用中[35]。含有mRNA的外泌體增強了對腫瘤生長的抑制作用，并提高了生存率。紫杉醇可通過促進細胞內微管重組及抑制解聚阻滯細胞的有絲分裂來抑制肺腺癌細胞的增殖，采用iRGD對乳源外泌體進行修飾，能使其靶向肺腺癌細胞，然后通過電穿孔將紫杉醇附著于iRGD修飾過的外泌體上形成外泌體電穿孔負載紫杉醇復合物用于肺腺癌，其選擇程度高只對腫瘤細胞有明顯的殺傷作用，而對正常細胞無明顯毒性[36]。

4.3 外泌體是藥物耐藥問題的潛在靶點靶向治療是近些年用于肺腺癌敏感突變患者的一種新方法，與反復住院放化療相比較具有毒副作用較小和簡便性等優勢，使部分患者得到較佳治療。但靶向藥物普遍存在的耐藥性使部分患者無法獲得長期緩解。Yuan等[37]通過分析腫瘤相關巨噬細胞上清液中的外泌體發現，其與吉非替尼一樣能夠抑制肺腺癌細胞，但同時又可通過參與AKT、ERK1/2和STAT3信號通路的再激活來增強肺腺癌對吉非替尼的耐藥，因此阻斷肺癌患者腫瘤相關巨噬細胞來源的外泌體可以減弱肺腺癌細胞對吉非替尼的耐藥?；熕幬锿瑯哟嬖谀退幮?，Zhang等[38]研究發現外泌體SNHG7在耐多西他賽的肺腺癌細胞中高表達，并通過誘導自噬和巨噬細胞M2型極化來增強肺腺癌細胞對多西他賽的耐藥性，因此抑制外泌體SNHG7可能是緩解耐藥的有效措施。

綜上，外泌體不僅可作為肺腺癌治療和藥物耐藥問題方面的潛在靶點，還能被用作藥物載體特異性地殺傷肺腺癌細胞。

4.4 外泌體用作肺腺癌綜合治療的療效評價

4.4.1外科手術的療效評價 目前針對肺腺癌的治療多采用的是以手術為主的綜合治療，治療后療效評價關乎治療方案是否需要調整，直接影響患者預后。Xue等[39]發現在健康個體和肺腺癌患者血漿外泌體中一些基因存在差異性表達，將肺腺癌患者治療前后的外泌體進行對比，發現肺腺癌患者中miR-484顯著表達且在術后降低。Wu等[40]通過建立Cox比例風險模型發現，與健康對照組相比，肺腺癌患者血清外泌體miR-1290顯著上調，在進行手術切除后顯著降低。因此，手術前后外泌體變化是肺腺癌手術療效評價的潛在指標。

4.4.2免疫治療的療效評價 對于PD-L1陽性的肺腺癌患者采用PD-L1抑制劑進行治療。Chen等[41]發現外泌體miR-16-5p含量和PD-L1表達可能存在負相關，采用PD-L1抑制劑治療后，當出現PD-L1水平升高也就是血清外泌體miR-16-5p水平降低時，肺腺癌患者的總生存率和無進展生存率會增加。Yang等[42]發現血小板蛋白2(thrombospondin 2，THBS2)是來源于特定的癌癥相關成纖維細胞亞群的蛋白，且高侵襲性的肺腺癌細胞可優先通過外泌體分泌THBS2來減少免疫細胞浸潤從而促進肺腺癌的發生發展，因此在臨床中THBS2高表達常預示著患者對免疫治療反應差和治療后生存期短。

4.4.3化療的療效評價 化療是腫瘤治療常采用的一種治療方式。鉑類是肺腺癌常采用的化療藥物，Yuwen等[43]通過對采用鉑類化療患者體內外泌體的分析發現，對鉑類耐藥患者循環外泌體miR-425-3p水平較高，認為其可以作為預測鉑類藥物化療臨床療效的生物標志物。Peng等[44]發現乳酸脫氫酶C4在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織，通過進一步研究發現肺腺癌患者血清來源外泌體中乳酸脫氫酶C4的表達與藥物治療呈負相關，與肺腺癌復發呈正相關，是判斷治療效果的獨立因素。

綜上，外泌體作為一種新型、無創的檢查手段，為評估肺腺癌綜合治療的效果開辟了新路徑，但仍需要大量的研究來證實。

5 小結與展望

綜上，外泌體在肺腺癌早期診斷和治療中均扮演著重要角色，本文對外泌體用于肺結節良惡性鑒別、在肺腺癌治療潛在靶點及療效評價中的作用作了簡單介紹。但目前外泌體在肺腺癌的研究中仍有些許的不足，如外泌體檢測方法不夠簡便、快捷、有效和低成本，關于肺腺癌的早期診斷、治療等的樣本量太小，仍需更多的試驗樣本來證明可行性。希望隨著對外泌體更加深入的研究，多源外泌體聯合檢測以及外泌體作為藥物載體能夠解決目前臨床診斷、耐藥等問題，使其更早應用于臨床，造福廣大患者。