基因治療在眼底血管性疾病中的應用和展望

張朝陽，張敬香，張敬法

0 引言

隨著遺傳學基礎研究取得重大進展，基因治療已經(jīng)成為很多難以治愈疾病的潛在治療選擇。基因治療在眼部的應用取得了巨大成功，具體原因如下：(1)眼睛具有解剖尺寸小、多細分隔間、便于手術進入等特點，因此每個基因載體經(jīng)眼內(nèi)注射后可以形成局部高濃度，即大約每100μL達到1.0×1010至2.0×1010拷貝數(shù)，大大減少了治療所需的載體總量。(2)由于血-視網(wǎng)膜屏障和獨特的眼內(nèi)微環(huán)境，使眼睛成為相對封閉和相對免疫豁免的區(qū)域，這些特性可以限制載體的全身擴散、并減少免疫反應。(3)眼睛是成對存在的，因此基因治療可以在動物模型和臨床試驗受試者中進行自身比較。鑒于以上獨特優(yōu)勢，眼睛一直處于基因治療轉化研究的前沿領地[1]。2017-12，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準了首個用于眼遺傳性疾病的基因治療產(chǎn)品Luxturna，用于治療2型萊伯氏先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis 2,LCA2)[2]。Luxturna基于腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)載體，采用基因補充策略將正常的人源RPE65基因?qū)牖颊咭暰W(wǎng)膜。Luxturna的問世為遺傳性和獲得性視網(wǎng)膜疾病基因治療的臨床轉化研究奠定了基礎。目前，數(shù)十項視網(wǎng)膜基因治療臨床試驗正在開展，所涉及的疾病包括全色盲、1型萊伯氏先天性黑矇、Stargardt病、X連鎖視網(wǎng)膜色素變性、Usher綜合征、無脈絡膜癥、視網(wǎng)膜色素變性、X染色體連鎖視網(wǎng)膜劈裂、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)等[3-4]。

基因治療在單基因遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases,IRDs)中取得了巨大成功，但該類疾病比例較低(約為1/3000)，且具有基因和表型多樣性(>300個致病基因)，因此對于罕見突變的特異性治療的可行性和成本效益都提出了巨大挑戰(zhàn)[5]。相比之下，獲得性視網(wǎng)膜疾病，如以AMD和DR為代表的眼底血管性疾病的受眾群體十分龐大，且該類疾病具有相似的發(fā)病機制和干預靶點，因此在基因治療的應用方面具有巨大潛力。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，AMD和DR分列全球性致盲眼病的第3和第5位。AMD是全球性老年人視力損害的主要原因，目前約有超過1.9億患者，預計到2040年上升至2.88億[6]；DR是全球性工作人群的主要致盲眼病之一，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟第10版的數(shù)據(jù)(IDF Diabetes Atlas),2021年全球約5.37億成年人患有糖尿病，預計到2030年將上升至6.43億，其中1/3的糖尿病患者會發(fā)生不同程度的視網(wǎng)膜病變[7]。此外，眼底血管性疾病還包括視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusions,RVOs)、病理性近視繼發(fā)脈絡膜新生血管等。這些疾病具有相似的發(fā)病機制，其中一個關鍵靶點是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[8]，且anti-VEGF治療已成為該類疾病的金標準和一線療法，因此基于VEGF及其相關信號通路的基因治療研究和臨床試驗是當前該領域的研究熱點[9-10]。本綜述首先介紹基因治療的基本概念和要素，隨后重點討論基因補充和基因編輯在nAMD和DR中的探索、應用、挑戰(zhàn)以及未來的發(fā)展方向。

1 基因治療概述

在醫(yī)學領域，基因治療特指將具體的、有針對性的核酸聚合物(特別是外源正常基因)導入患者的靶細胞，并在患者體內(nèi)產(chǎn)生相應基因的直接產(chǎn)物，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。按這樣的理解，曾被視為基因治療先驅(qū)的減毒活疫苗治療并不屬于現(xiàn)代基因治療的范疇，因為這些疫苗并不改變接種者的基因。另一方面，進行輸血、骨髓移植和器官移植等治療時，雖然把異體DNA帶給了受體患者，但由于其導入的不是特定的基因，也不是依靠特定的基因發(fā)揮治療作用，因此也不屬于基因治療。但利用新技術在DNA水平進行修飾(如基因編輯技術)以治療疾病的策略應該屬于基因治療的范疇。

1.1基因治療的策略基因治療的策略主要包括基因補充和基因編輯(圖1)。基因補充主要是將外源性遺傳物質(zhì)導入遺傳缺陷的細胞；而基因編輯主要是對內(nèi)源性基因組進行精確修飾，以糾正突變的等位基因。基因補充對常染色體隱性遺傳的突變很有效；然而，功能獲得性(gain-of-function)顯性突變則需要通過敲除或抑制突變等位基因來糾正疾病表型[1]。

圖1 基因補充和基因編輯在眼科中的應用實例 A:目前通過“基因補充”治療視網(wǎng)膜疾病的臨床試驗及相關載體信息；B:“基因編輯”技術用于矯正突變基因，如CRISPR/Cas9位點特異性核酸酶矯正CEP290基因。

1.2眼底基因治療給藥途徑科學的給藥途徑是保證基因特異且有效導入眼底的重要決定因素。最常見的給藥途徑是玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜下腔注射，另有一些研究采用脈絡膜上腔給藥。如圖2所示，玻璃體腔注射可在玻璃體中釋放治療藥物，有限轉染內(nèi)層視網(wǎng)膜；而視網(wǎng)膜下腔注射是將載體注射至視網(wǎng)膜下腔，即視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)和光感受器細胞(photoreceptor,PRs)之間，主要靶向RPE和PRs。盡管玻璃體腔注射更容易操作且載體分布更廣泛，但對于RPE和PRs的轉染弱于視網(wǎng)膜下腔注射，其原因可能是由于玻璃體和視網(wǎng)膜內(nèi)存在物理屏障而使載體無法有效到達靶細胞[11]。然而，視網(wǎng)膜下腔注射會導致視網(wǎng)膜短暫脫離，使得原本脆弱的病變視網(wǎng)膜雪上加霜。脈絡膜上腔給藥為nAMD和其他脈絡膜疾病的藥物遞送提供了額外選擇。

圖2 視網(wǎng)膜基因治療的給藥途徑 紅色字體表示處在臨床試驗階段的基因治療。

1.3基因治療的載體

1.3.1病毒載體基因治療最常用的載體是病毒載體，包括腺病毒(adenovirus，Ad)、慢病毒(lentivirus，LV)和腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)三種。每一種病毒載體都具有各自的優(yōu)缺點，見表1。

表1 腺病毒和慢病毒及腺相關病毒的特點比較

1.3.2非病毒載體非病毒載體常用電穿孔法、顯微注射法和脂質(zhì)體等導入目的基因。與病毒載體相比，非病毒基因載體在降低免疫反應風險和轉入更大基因的潛力方面具有優(yōu)勢。最近，一些研究將非病毒載體用于視網(wǎng)膜基因?qū)耄l(fā)現(xiàn)至少在短期內(nèi)對某些IRDs動物模型的治療是有效的[12]。然而，考慮到非病毒載體治療持續(xù)時間較短及轉染效率偏低(特別是在大型動物模型中)，因此限制了其在視網(wǎng)膜基因治療中的廣泛應用。在非病毒基因治療領域，反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AON)可以用來靶向突變等位基因，導致異常剪接。最近的一項臨床試驗通過反復玻璃體腔內(nèi)注射AONs，以此靶向LCA10的致病基因(CEP290 IVS26等位基因)，結果表明該治療沒有出現(xiàn)嚴重的不良事件，且患者在3mo時視力提高[13]。基于此，相關臨床試驗(NCT03913143、NCT03780257)正在進行，這將為AONs是否適用于視網(wǎng)膜基因治療提供重要證據(jù)，但該方法需要多次給藥。

2 眼底血管性疾病

2.1新生血管性年齡相關性黃斑變性AMD的晚期病理表現(xiàn)包括：地圖樣萎縮(geographic atrophy,GA)和新生血管性AMD(nAMD)，但目前臨床上只有針對nAMD的治療方法。Anti-VEGF藥物已成為治療nAMD的一線藥物，該治療能顯著抑制脈絡膜新生血管、減少視網(wǎng)膜滲漏，并提高患者視力[14-16]。然而，高頻的玻璃體腔注射造成患者精神上和經(jīng)濟上的雙重負擔，導致患者依從性較差，所以真實世界中anti-VEGF的治療效果并沒有達到關鍵隨機對照試驗(randomized controlled trial,RCT)中的水平[6,17-18]。

2.2DR 糖尿病患者中約30%～40%會出現(xiàn)不同程度的DR，其中5%～10%會表現(xiàn)出威脅視力的DR(vision threatening DR,VTDR)，包括嚴重的非增殖性DR(non-proliferative DR,NPDR)、增殖性DR(proliferative DR,PDR)和糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)[19]。需要注意的是，PDR和DME是造成 DR 患者視力降低的主要原因，其中DME可能出現(xiàn)在DR病程的任何階段[20]。由于VEGF是導致DR發(fā)病的重要因子，所以目前anti-VEGF也是PDR和DME的一線治療方法[21]。同樣，anti-VEGF治療PDR和DME也存在著頻繁注射、費用昂貴以及患者依從性差等劣勢，導致真實世界中的治療效果不及臨床試驗[22-23]。

2.3其他眼底血管性疾病由于VEGF/VEGFR相關信號通路在眼底血管性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，所以VEGF抑制劑也常用于治療RVOs繼發(fā)的黃斑水腫(RVOs-ME)、脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)等。RVOs是僅次于DR的最常見視網(wǎng)膜血管類疾病，目前世界范圍內(nèi)患者約為2800萬人[24]，RVOs-ME的anti-VEGF治療同樣面臨著與nAMD、DME、PDR類似的困擾。ROP是一種危及視力的兒童視網(wǎng)膜血管疾病，在新生血管增殖期可接受VEGF抑制劑治療。由于患兒處于發(fā)育階段，抗VEGF治療需要合理把握治療窗口、治療劑量和治療頻次[25]。

3 基因治療在眼底血管性疾病中的應用

與單基因IRDs相比，眼底血管性疾病的基因治療更多地依賴于相關信號通路/治療靶點(如VEGF)，對細胞類型或位點的特異性要求相對較低[26]。但在監(jiān)管批準和臨床應用方面，眼底血管性疾病基因治療的門檻較高，即需要與現(xiàn)有標準療法進行嚴格評估和對比，且表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢的前提下才能被采用。如前文所述，常規(guī)的anti-VEGF治療存在諸多問題導致患者依從性較差、治療效果欠佳。而基因治療介導的anti-VEGF策略可以有效克服這些短板[27]，其最大的優(yōu)勢是可以實現(xiàn)長期有效的VEGF阻斷，避免了頻繁的眼內(nèi)注射[26]。

針對眼底血管性疾病，研究者嘗試了各種基因治療策略(圖3)，主要包括基因補充、基因編輯、以及RNA干擾等技術[26]。其中，通過基因補充“內(nèi)源性anti-VEGF”的基因治療研究最多，且最接近臨床轉化[28-30]。表2匯總了目前正在進行的眼底血管性疾病的基因治療臨床試驗，其中nAMD相關臨床試驗最多，此外還涉及干性AMD、DME以及DR(非DME)。

圖3 眼底血管性疾病的常規(guī)anti-VEGF治療和基因治療 常規(guī)治療采用定期、多次注射anti-VEGF藥物；基因治療策略主要包括基因補充、基因編輯以及基因沉默。

3.1基因補充如前所述，基因補充可以使治療性蛋白長期內(nèi)源性生成，相當于創(chuàng)建了一個“眼內(nèi)生物工廠”。由于anti-VEGF已成為眼底血管性疾病的一線治療藥物，所以基于基因治療持續(xù)表達anti-VEGF蛋白是最容易實現(xiàn)臨床轉化的。正如表2所示，當前大部分眼底血管性疾病基因治療臨床試驗都采用了AAV介導的基因補充anti-VEGF相關分子的策略，例如表達合成的重組anti-VEGF蛋白(aflibercept)或內(nèi)源性VEGF抑制劑(soluble fms-like tyrosine kinase 1,SFlt-1)。本節(jié)我們將重點介紹3種基于anti-VEGF的基因治療產(chǎn)品。

表2 AMD和DR基因治療臨床試驗匯總 (截至2022-04)

3.1.1ADVM-022 ADVM-022(Adverum Biotechnologies,Inc.)通過玻璃體腔內(nèi)注射AAV2.7m8載體誘導眼內(nèi)產(chǎn)生aflibercept，目前用來治療nAMD和DME。一項Ⅰ期OPTIC研究的2a結果顯示：nAMD患者玻璃體腔內(nèi)注射ADVM-022耐受性良好；眼內(nèi)aflibercept可持續(xù)產(chǎn)生2a，減少了患者頻繁注射的治療負擔；期間患者視力穩(wěn)定，視網(wǎng)膜厚度降低(ADVM-022 Intravitreal Gene Therapy for Neovascular AMD - Phase 1 OPTIC Study；NCT03748784)。ADVM-022針對nAMD患者的Ⅲ期臨床試驗正在計劃中。此外，ADVM-022針對DME患者的一項Ⅱ期臨床試驗正在進行中(NCT04418427)。

3.1.2SFlt-1 SFlt-1是一種機體天然的內(nèi)源性VEGF抑制劑，通過AAV介導的基因補充SFlt-1可以實現(xiàn)其內(nèi)源性表達，目前用來治療nAMD[28-30]。一項Ⅰ期臨床試驗(NCT01024998)結果顯示：玻璃體腔內(nèi)注射AAV2-sFlt-1是安全的，且耐受性良好；但sFlt-1的表達水平和療效并不穩(wěn)定，研究者認為可能是受到本底anti-AAV2血清抗體的影響[29]。在另一項Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗(NCT01494805)中，視網(wǎng)膜下腔注射rAAV-sFlt-1是安全的且耐受性良好；但該治療并沒有顯著改善患者視力或視網(wǎng)膜厚度[28,31]。

3.1.3RGX-314 RGX-314(REGENXBIO Inc.)通過AAV介導的基因補充anti-VEGF抗原結合片段(antigen-binding fragment,Fab)，目前用以治療nAMD和DR(非DME)。一項Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗(NCT03066258)已經(jīng)證明該治療對于nAMD患者具有良好的耐受性和安全性；RGX-314可穩(wěn)定患者視力、降低視網(wǎng)膜厚度[3]。同時，針對nAMD的Ⅱ期(NCT03999801)和Ⅱb/Ⅲ期(NCT04514653、NCT04704921、NCT04832724)臨床試驗正在進行中。此外，針對DR(非DME)患者的一項Ⅱ期臨床試驗(NCT04567550)正在進行中。

3.1.4其他靶點的基因補充眼底血管性疾病的基因治療臨床試驗除了聚焦經(jīng)典靶點VEGF外，還涉及一些其他分子。兩項Ⅰ期臨床試驗通過基因補充生成內(nèi)源性抗血管生成因子用來治療nAMD，分別靶向色素上皮衍生因子(NCT00109499)、內(nèi)皮抑素和血管抑制素(NCT01301443)[32-33]。另有一些臨床試驗靶向補體途徑的抑制因子，例如靶向CD59治療nAMD(NCT03585556)和干性AMD(NCT03144999)；靶向補體因子Ⅰ(NCT03846193、NCT04437368、NCT04566445)用以治療干性AMD。

3.2基因編輯基于基因組中成簇有規(guī)律的間隔短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)的基因編輯技術在IRDs的治療中取得了巨大進展[34]，也為眼底血管性疾病的基因治療提供了新思路，即借助基因編輯技術對血管生成通路中的信號分子進行敲除/敲低來實現(xiàn)治療目的[35]。目前，基于基因編輯技術治療眼底血管性疾病僅限于臨床前研究，主要集中在小鼠CNV模型中[35-41]。這些研究大多采用視網(wǎng)膜下腔或玻璃體腔注射病毒載體，如AAV和慢病毒來導入核酸酶；另有一些研究嘗試采用非病毒載體，如直接使用預組裝的Cas9核糖核蛋白，以盡量減少免疫和抗體反應[38]。CRISPR基因編輯系統(tǒng)靶向的基因一般為血管生成通路相關信號分子，包括VEGF-A、VEGF受體2(VEGFR2)、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)等[35-41]。基因編輯技術可以實現(xiàn)長期抗新生血管的作用，但也要考慮其脫靶效應帶來的風險，這些問題將在未來的臨床前和臨床試驗中予以考慮和優(yōu)化。

3.3基因沉默基因沉默在基因治療中的應用也十分廣泛。基因沉默是把反義核酸(如siRNA、shRNA、反義RNA、反義DNA等)和核酶等導入細胞內(nèi)，在轉錄和翻譯水平阻斷特定基因的異常表達，或者破壞某個基因結構使其不表達，從而實現(xiàn)治療的目的[42]。其中，RNA干擾技術(RNAinterfere,RNAi)已在眼底血管性疾病治療中進行了相關探索。一項Ⅲ期臨床試驗(NCT00557791)結果顯示：一種靶向VEGF的siRNA藥物Bevasiranib治療nAMD的效果沒有達到預期，因此試驗終止[43]。另一種靶向VEGF受體1(VEGFR1)的RNAi藥物Sirna-027(AGN211745)進行了Ⅱ期臨床試驗(NCT00395057)評估，同樣也因治療效果不佳而選擇終止[42]。需要注意的是，單純的RNAi藥物并不能提供持久的抑制效果，所以仍需要進行頻繁眼內(nèi)注射；而病毒(如AAV)介導的內(nèi)源性shRNA/miRNA可以實現(xiàn)長期有效抑制VEGF的目的[44]。

4 討論與展望

基因治療在IRDs中的研究和應用已趨向成熟，這也為眼底血管性疾病的基因治療提供了理論和技術基礎。基因治療通過提供有效和持續(xù)的抗血管生成藥物釋放，克服了傳統(tǒng)療法的缺陷，進而減輕了患者的經(jīng)濟和精神負擔。雖然眼底血管性疾病的基因治療具有巨大的應用潛力，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)。與常規(guī)anti-VEGF治療相比，基因治療最大優(yōu)勢在于治療效果的持久性，但持續(xù)抑制VEGF可能是一把雙刃劍。臨床研究表明頻繁給予anti-VEGF治療會引起視網(wǎng)膜萎縮或地圖樣萎縮[45-46]，其原因可能是VEGF本身的生理功能也受到了長期慢性的阻斷，因此探索可調(diào)控的基因治療可有效解決此類問題[47-49]。此外，眼底血管性疾病基因治療受制于所選靶點的有效性，因此對該類疾病發(fā)病機制的探索尤為重要，以便為基因治療提供更加關鍵的治療靶點。在基礎研究中，建立更加具有代表性的AMD/DR/DME動物模型有助于該類疾病基因治療的轉化醫(yī)學研究。

綜上所述，大量基礎和臨床研究已證實基于基因補充、基因編輯和基因沉默靶向血管生成通路相關信號分子(如VEGF/VEGFR)治療眼底血管性疾病是安全且有效的；同時，多項正在進行的臨床試驗也將推進眼底血管性疾病基因治療的臨床轉化。基因治療的發(fā)展將會為眾多眼底血管性疾病患者帶來福音。