連接蛋白43:致盲性眼病治療新靶點

程馨儀，李 慧，王 方,2

0 引言

縫隙連接(gap junctions,GJs)又稱縫隙連接斑塊，由數十個甚至數千個排列整齊且緊密相鄰的通道組成。每一個完整的通道分別由相鄰細胞膜上兩個半通道(hemichannel)對接而成。半通道是由6個連接蛋白(connexins,Cxs)亞單位構成的六聚體中空結構，其中心孔徑為1.5nm，允許鈣離子等可溶性離子和分子量小于1.2kDa的小分子包括營養素、氨基酸、核苷酸、多胺、第二信使或調節分子等直接通過。該通道具有親水性、低選擇性和低電阻等特點，主要功能是介導細胞間電和化學信號的傳遞，即縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)，確保細胞代謝和電耦合，從而維持組織和器官內環境平衡[1-2]。

Cxs在人類和小鼠中分別存在21種和20種亞型。其中，連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是分布最廣泛、研究最深入的一種亞型[3]。Cx43不僅參與細胞間通訊，還參與細胞自噬、黏附、遷移、增殖分化等過程[4]，它對維持正常眼組織的生理功能具有重要意義。研究發現，Cx43在角膜炎、白內障、青光眼、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)等常見致盲性眼病中發揮重要作用，參與炎癥、氧化應激、上皮-間充質樣細胞轉換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、血管滲漏與新生血管形成等病理過程。目前，多項研究表明靶向Cx43治療具有良好的臨床應用前景，比如以Cx43為靶點治療角膜炎的藥物已進入人類臨床試驗Ⅱ期。本文將就Cx43在上述常見致盲性眼病發病機制中的作用和靶向Cx43治療進展作一綜述。

1 Cx43的結構與功能

Cx43基因GJA1 (gap junction protein alpha1)定位于6q22.31，其編碼的蛋白質分子質量為43kD，故命名為Cx43[4]。Cx43單體結構由4個跨膜結構域、2個胞外環和3個胞內結構域組成，胞內結構域包括胞內環、氨基末端和羧基末端。Cx43與其他Cxs亞型的主要區別在于胞內環和羧基末端氨基酸序列的差異[5]。Cx43羧基末端含有150個氨基酸，存在多種轉錄后修飾和蛋白質結合的位點，調控Cx43蛋白的內吞、降解及通道門控，還可以與β-連環蛋白、周期蛋白E、Src蛋白激酶等相互作用，調節細胞的生長、分化和遷移等正常生理過程[6]。在炎癥、氧化應激、pH值降低等病理條件下，Cx43半通道開放并在細胞質和細胞外環境之間形成直接聯系，允許Na+、K+自由通過，引起細胞內鈣超載，促進小分子如ATP、谷氨酸等逃逸，抑制細胞代謝和細胞膜去極化，導致細胞損傷[7]。

2 Cx43與常見致盲性眼病

眼組織中，Cx43主要分布于角膜、晶狀體和視網膜，涉及的種屬廣泛，包括人、鼠、兔、雞、豬、斑馬魚等[8]。Cx43表達和分布異常，或Cx43介導的細胞間通訊功能異常與多種致盲性眼病密切相關。

2.1Cx43與角膜炎Cx43分布于角膜的上皮細胞層及基質層，形成角膜細胞間相互通訊的功能性網絡[9-10]。Chen等[11]通過選擇性地損傷體外培養的原代人或小鼠角膜基質細胞中的單個靶細胞，引起靶細胞膜的短暫破裂，發現Cx43介導了靶細胞與其相鄰細胞間的Ca2+傳導，Ca2+內流顯著增加。研究發現，病毒的雙鏈RNA類似物聚肌苷酸胞苷酸能夠抑制人角膜成纖維細胞中Cx43表達和GJIC活性，提示病毒感染下調GJIC的活性可能導致角膜基質內穩態破壞[10]。在離體培養的人角膜成纖維細胞中，Cx43可以被腫瘤壞死因子α介導的泛素-蛋白酶體途徑降解[12]。而在化學燒傷或感染的人角膜臨床樣本中，Cx43信使RNA和蛋白表達水平顯著上調，與角膜炎癥密切相關[13]。Qin等[14]采用shRNA-Cx43腺病毒抑制真菌性角膜炎小鼠模型中Cx43的表達或通過IL-17/Akt信號通路抑制Cx43，發現Cx43表達減少可以促進角膜緣血管內皮細胞激活，調節角膜早期炎癥反應，利于抵抗真菌感染和角膜上皮損傷愈合。

2.2Cx43與白內障Cx43主要分布于晶狀體的上皮細胞，其表達隨著晶狀體上皮細胞分化為成熟的纖維細胞而下調[15]。由于晶狀體無血管，晶狀體的大部分代謝物質通過晶狀體上皮細胞間和晶狀體纖維之間的縫隙連接通道進行運輸[16]。與正常透明晶狀體相比，Cx43在白內障患者的晶狀體中表達上調近50%[17]。年齡相關性白內障的風險隨著氧化應激和紫外線暴露增加[18-19]，采用過氧化氫或紫外線輻射處理人晶狀體上皮細胞HLE-B3可以激活Cx43半通道，促進氧化還原代謝分子如過氧化氫、氧化型谷胱甘肽、還原型谷光甘肽的內流或外流，進而保護晶狀體免受氧化應激損傷[20]。Liu等[21]通過表達泛素-K6W的轉基因小鼠發現，泛素化修飾的Cx43在小鼠晶狀體上皮細胞中積累，導致Ca+濃度顯著升高及鈣蛋白酶過度激活，誘發白內障。此外，DeRosa等[22]報道Cx43可以與Cx50-S50P突變相互作用，抑制小鼠晶狀體上皮細胞中Cx43介導的GJIC，促進白內障形成。

2.3Cx43與青光眼研究發現，Cx43在青光眼患者視神經和視網膜組織中表達升高并與星形膠質細胞重塑和軸突順行運輸有關[23]，星形膠質細胞重塑促進了視神經篩板區結構的改變，這一過程可促進青光眼進展[24]。Liu等[25]降低大鼠的眼灌注壓并向其玻璃體腔注射靶向Cx43基因的腺相關病毒載體以抑制膠質細胞中Cx43的表達，發現Cx43表達降低能夠損害小動脈和小靜脈的血管反應性，間接證明了Cx43介導的膠質細胞GJIC具有主動調節靜息小靜脈直徑的生理功能。在單側持續眼壓升高的小鼠模型中，Cx43介導星形膠質細胞間代謝物質的重新分布，緩解了高眼壓所致的視神經功能損傷[26]。此外，Xu等[27]在慢性眼壓升高的小鼠模型中發現，視網膜小膠質細胞大量增殖并遷移至神經纖維層和節細胞層，這與Müller細胞中Cx43半通道激活并釋放ATP密切相關。

房水分泌和引流的平衡調節是控制青光眼的主要手段[28]。縫隙連接介導的睫狀體上皮跨細胞離子轉運被認為是房水主動分泌的動力之一[29]。研究發現，小鼠睫狀體色素上皮細胞中Cx43表達受Nectin信號通路調控，Cx43穩定表達可以促進房水分泌并維持眼內壓[30]。敲除Cx43基因使小鼠睫狀體無色素上皮和虹膜中的Cx43部分失活后，色素上皮和無色素上皮之間出現擴張，眼壓顯著降低[31]。Cx43在正常小梁網組織中穩定表達，Yu等[32]在小鼠前房注射縫隙連接通道抑制劑甘珀酸或氟芬那酸，發現抑制GJs可以導致房水流出阻力增加和眼壓升高。

2.4Cx43與DR 正常條件下，Cx43在視網膜血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞中表達豐富[33]。研究發現，Cx43可以通過介導視網膜神經血管異常改變、炎癥反應、氧化應激、EMT等過程參與DR。

Cx43在正常小鼠視網膜毛細血管和供血動脈之間沿著內皮細胞連接呈線狀表達，參與血管內皮細胞與周細胞之間的功能性偶聯[34]。Tien等[35]通過研究糖尿病捐獻眼的視網膜組織發現，Cx43表達下調伴隨周細胞丟失和新生血管形成。同樣，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中，周細胞覆蓋血管范圍減小伴隨Cx43表達下調[36]。Tien等[37]報道，大鼠玻璃體腔注射Cx43小干擾RNA抑制Cx43的表達可以促進血管內皮細胞凋亡和新生血管形成，并引起血管滲漏和視網膜增厚。研究發現，高糖環境下培養的血管內皮細胞或共培養的周細胞和Müller細胞中，Cx43表達下調并破壞了血管內皮細胞之間、周細胞和Müller細胞之間的GJIC，從而影響細胞活性[38-39]。此外，高糖還可以誘導大鼠視網膜血管內皮細胞中線粒體Cx43(mitochondria Cx43,mtCx43)表達水平降低，促進了線粒體的斷裂和血管內皮細胞凋亡，而維持mtCx43水平能夠減少血管內皮細胞的丟失[40]。

Mugisho等[41]研究發現，Cx43在增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者和DR動物模型Akimba小鼠的視網膜組織中表達增加，Liu等[42]也證實Cx43和星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白在糖尿病小鼠視網膜和PDR患者纖維血管膜中表達顯著增加。低氧狀態下，小鼠視網膜星形膠質細胞中Cx43磷酸化增加導致細胞間偶聯增加，促使細胞毒性分子從瀕臨死亡的星形膠質細胞中轉移至其相鄰的健康細胞，擴大了缺氧誘導的細胞毒性損害，嚴重破壞了視網膜血管定向生成所需要的星形膠質細胞網絡支架，進而促進異常血管生長[43]。以上研究提示Cx43和星型膠質細胞在新生血管的形成中發揮重要作用。

炎癥在DR病理過程中亦發揮重要作用。Mugisho等[44]采用高糖聯合炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18處理人視網膜色素上皮細胞ARPE-19，發現與單純炎癥因子處理組相比，聯合處理組的ARPE-19細胞中的IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、可溶性黏附分子、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和ATP等因子的表達顯著上調；而采用Cx43半通道阻滯劑Peptide5處理可明顯減少炎癥因子的表達和ATP釋放，提示Cx43半通道開放擴大了DR病理過程中的炎癥反應。Lyon等[45]研究發現高糖聯合炎癥因子IL-1β、IL-18處理可誘導ARPE-19細胞發生EMT，表現為細胞形態發生改變、閉鎖小帶蛋白1表達下降和α-平滑肌肌動蛋白表達上調，而應用Cx43半通道阻滯劑Tonabersat可阻遏EMT過程。研究發現，炎癥因子和高糖可以促使ARPE-19細胞Cx43半通道開放并大量釋放ATP，ATP促進炎癥體復合物形成并增加IL-1β和VEGF的釋放，這些促炎因子的釋放可以進一步激活Cx43半通道開放，從而形成一個永存的自分泌反饋環[46]。

3 Cx43靶向藥物與眼部疾病治療

Cx43靶向藥物主要包括三種，分別為Cx43模擬肽、Tonabersat和反義寡核苷酸(Antisense Oligodeoxynucleotides,AsODN)。

Cx43模擬肽包含以Cx43胞外環為靶點的Gap26、Gap27、Peptide 5和以Cx43 羧基末端為靶點的α羧基末端合成肽(alpha carboxyl-terminal peptides,αCT1)[47]。研究發現，Gap27可以加速離體人角膜傷口中巨噬細胞的浸潤并促進角膜傷口愈合，而在活體大鼠角膜縫合模型中卻發現，Gap27促進粒細胞浸潤和炎癥介質的釋放，表明Gap27的促角膜愈合作用適用于淺表傷口，而不適用于深層角膜損傷[48]。應用Peptide 5抑制ARPE-19細胞的Cx43半通道后，可以下調高糖和炎癥因子誘導的乳酸脫氫酶和ATP的釋放，并阻止Cx43的內吞和降解，從而保護視網膜色素上皮外屏障的完整性[49]。在大鼠角膜創傷模型中，αCT1可以競爭性抑制Cx43與閉鎖小帶蛋白1結合從而降低Cx43的活性，減輕炎癥反應并加快傷口愈合[50]。Obert等[51]采用激光光凝誘導小鼠脈絡膜新生血管或強光暴露破壞小鼠視網膜外屏障后，給予αCT1滴眼液治療，結果顯示其不僅可以減少脈絡膜新生血管的生成及滲漏，并且可以阻止強光損傷引起的RPE細胞形態紊亂，同時體外實驗顯示αCT1可以獨立于Cx43穩定RPE細胞的緊密連接。Huang等[52]應用納米顆粒來裝載Cx43模擬肽并給予視網膜缺血大鼠模型玻璃體腔注射，持續釋放的Cx43模擬肽可以抑制炎癥反應，并防止缺血引起的視網膜變薄和視網膜血管破壞，有望應用于DR、青光眼等與視網膜缺血相關的眼病治療中。

Tonabersat是一種新型苯并吡喃衍生物,其作用效果與Peptide 5類似。Tonabersat的優勢主要在于它能夠通過血腦屏障，故可以采用口服途徑給藥[46]，多項研究證實Tonabersat在DR病理過程中具有保護視網膜的結構和功能的重要作用，其安全性驗證正在進行Ⅱ期臨床試驗[53]。最新研究發現，Tonabersat可以通過抑制炎癥體途徑減輕干性黃斑變性大鼠模型的炎癥反應，并保護視網膜光感受器和雙極細胞的功能[54]。

AsODN是由13～25個核苷酸組成的單鏈核酸，其堿基序列與目標基因RNA序列互補并特異性地結合形成雙鏈結構，從而沉默靶基因[55]。兔青光眼小梁切除術模型中，結膜下注射Cx43 AsODN可以抑制結膜瘢痕形成和纖維化[56]。Grupcheva等[57]應用Cx43AsOSN處理大鼠機械刮傷角膜模型，發現AsODN減輕了角膜基質的水腫和炎癥反應，更完整地修復角膜上皮基底層，從而顯著提高了傷口的閉合率。Ormonde等[58]首次報道了5例應用Cx43 AsODN治療嚴重眼表燒傷患者的前瞻性臨床研究，結果顯示Cx43 AsODN治療1～2d后炎癥反應明顯減輕，最終5例患者均獲得了完整、穩定的角膜上皮再生。目前，應用天然寡核苷酸Nexagon，CODA001治療角膜上皮缺損的人類Ⅱ期臨床試驗研究正在進行中[59]。

4 展望

Cx43在維持眼組織正常結構和功能方面發揮多重關鍵作用，如參與角膜細胞穩態、晶狀體代謝、眼內壓維持、星型膠質細胞激活和視網膜血管調節等。Cx43表達異常或其介導的縫隙連接通道異常與角膜炎、白內障、青光眼、DR等常見致盲性眼病發生發展密切相關。探索以Cx43為靶點的藥物有望為常見致盲性眼病的治療提供嶄新的方向。