糖尿病視網膜病變及糖尿病性黃斑水腫患者血清中CTRP9的表達

景海霞，張 書，白惠玲，劉 勤，，朱曉燕

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的眼部微血管并發癥。Yang等[1]調查發現，成年T2DM患者中DR的患病率為24.7%～37.5%，約1/10的T2DM患者將發展為威脅視力的DR[2]。由于T2DM的全球患病率持續上升，越來越多的患者受到DR的困擾，其中糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和增殖型糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是導致患者中、重度視力喪失的主要原因。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9(C1q/tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9)是一種主要由脂肪細胞分泌的細胞因子，已被證明與糖尿病及其相關并發癥進展有關，但其在DR中的作用和機制目前尚不清楚。本研究通過分析不同階段DR及DME患者血清中CTRP9的表達水平，探討CTRP9在DR及DME發病中的作用，為早期預防及監測病情變化尋找有價值的生物學指標。

1 對象和方法

1.1對象選取2021-04/2022-04甘肅省人民醫院眼科及內分泌科收治的T2DM患者135例作為試驗組，根據免散瞳眼底照相結果分為無DR(non-DR，NDR)組(45例)、非增殖型DR(non-proliferative DR，NPDR)組(45例)、PDR組(45例)；根據光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)結果將DR患者分為DME組(51例)、非DME組(39例)，眼底照相及OCT讀片均由同一位經驗豐富的眼底病醫生完成。另選取同期年齡、性別與T2DM患者相匹配的健康體檢者45例為正常對照組。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，經甘肅省人民醫院倫理委員會審核批準(批準號：2021-301)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.1納入標準試驗組：(1)年齡：45～75歲，經內分泌和眼科醫生明確診斷為T2DM或DR的患者；(2)T2DM的診斷符合2020年制定的《中國2型糖尿病防治指南》[3]；(3)DR分期符合《我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南(2014年版)》中建議的分期方法[4]。正常對照組：無糖尿病病史，空腹血糖<7.0mmol/L，隨機血糖<11.0mmol/L，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)<6.5%。

1.1.2排除標準試驗組：(1)1型糖尿病、妊娠期糖尿病、特殊類型糖尿病患者；(2)既往有眼內手術史、眼內注藥史(抗VEGF藥物或糖皮質激素)、視網膜激光光凝史；(3)有免疫性疾病、心腦血管疾病、血液系統疾病、惡性腫瘤、重度肝腎功能不全、嚴重感染性疾病者；(4)近期有抗炎、激素及免疫抑制劑藥物治療史；(5)近期有糖尿病高滲性昏迷、糖尿病酮癥酸中毒者。正常對照組：糖尿病、高血壓、合并心肝腎等嚴重功能障礙或患有其他全身性疾病，如炎癥性疾病、風濕病、感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病者。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集記錄所有受試者的性別、年齡、體質量指數(body mass index，BMI)及T2DM患者的糖尿病病程等臨床資料。

1.2.2CTRP9及生化指標的檢測收集所有受試者晨起空腹肘靜脈血5mL。以4500r/min離心10min，立即提取上層血清，分裝入無菌EP管內，置于-80℃超低溫冰箱中待測。(1)血清CTRP9水平檢測：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測血清中CTRP9水平，嚴格按照試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)說明操作進行，CTRP9可檢測水平為17.5～700pg/mL，批內及批間變異系數分別小于10%和12%。(2)生化指標檢測：使用Ci16200全自動化生化分析儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；使用TOSOH HLC-723G11分析儀檢測HbA1c。

2 結果

2.1納入受試者臨床資料比較正常對照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者年齡及性別差異均無統計學意義(P>0.05)，但NDR組、NPDR組、PDR組患者糖尿病病程差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。DME組與非DME組患者年齡、性別、糖尿病病程差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組受試者基線資料比較

表2 DME組與非DME組患者基線資料比較

正常對照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者血清CTRP9水平差異有統計意義(P<0.001)，且正常對照組>NDR組>NPDR組>PDR組，見表3。DME組與非DME組患者血清CTRP9水平差異有統計學意義(P<0.001)，且非DME組>DME組，見表4。

表3 各組受試者臨床資料比較

表4 DME組與非DME組患者臨床資料比較

2.2血清CTRP9水平與臨床資料的相關性分析Spearman秩相關性分析顯示，T2DM患者血清CTRP9水平與糖尿病病程(rs=-0.345，P<0.001)、HbA1c(rs=-0.181，P<0.05)呈負相關關系，與BMI(rs=0.199，P<0.05)呈正相關關系；DR患者血清CTRP9水平與糖尿病病程(rs=-0.251，P<0.05)呈負相關關系；DME患者血清CTRP9水平與FBG(rs=-0.370，P<0.05)、HbA1c(rs=-0.421，P<0.05)呈負相關關系。

2.3DR及DME發生的危險因素分析

2.3.1DR發生的危險因素分析以是否發生DR為因變量，將糖尿病病程、BMI、HbA1c、HDL-C、CTRP9作為自變量，采用一次性進入法進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示，糖尿病病程(OR=1.194，95%CI：1.068～1.335)、血清CTRP9水平(OR=0.936，95%CI：0.907～0.966)為影響DR發生的危險因素，且隨著血清CTRP9水平降低，DR的患病風險顯著增加，見表5。

表5 DR危險因素的Logistic回歸分析

2.3.2DME發生的危險因素分析以是否發生DME為因變量，將CTRP9作為自變量，將變量采用一次性進入法進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示，血清CTRP9水平為影響DME發生的危險因素(b=-0.176，SB=0.038，Waldχ2=21.424，OR=0.838，95%CI：0.778～0.903，P<0.001)，且隨著CTRP9水平降低，DME的患病風險顯著增加。

3 討論

CTRP9是屬于CTRP家族的脂聯素旁系同源物之一，主要在脂肪組織中表達，與脂聯素形成異源三聚體。gCTRP9是CTRP9主要的循環亞型，其是CTRP9的C端球狀結構域異構體，CTRP9的蛋白水解切割則會導致球狀結構域gCTRP9釋放[5]。CTRP9可對多種與T2DM相關的危險因素起到抑制作用。研究發現，CTRP9在ob/ob肥胖小鼠脂肪組織、外周血中表達水平上調[6]，而CTRP9缺陷小鼠胰島素抵抗(insulin resistance，IR)加重[7]，這兩項研究結果提示血清CTRP9水平與機體肥胖狀態有關，且在改善IR方面有一定作用。Guan等[8]認為，CTRP9是一種抗炎因子，與哮喘、神經炎和DR等多種疾病炎癥因子的產生呈負相關。此外，CTRP9還具有保護血管內皮細胞的作用[9-10]。Jung等[10]研究發現，CTRP9可以激活血管內皮細胞中的蛋白激酶，抑制白細胞黏附和血管炎癥的發生，且其過表達可抑制核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的激活，說明CTRP9有抗氧化應激反應的作用。以上研究表明，CTRP9在改善IR、抗炎、保護血管內皮細胞及抗氧化應激等方面發揮重要作用。

本研究結果顯示，正常對照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者血清CTRP9水平差異有統計意義(P<0.001)，且正常對照組>NDR組>NPDR組>PDR組，說明CTRP9水平降低可能在DR的進展中起重要作用。相關研究也表明，CTRP9水平降低是T2DM患者并發DR的危險因素[11]。王欣榮等[12]研究顯示，CTRP9與T2DM患者并發DR獨立相關，且隨著DR的進展，CTRP9水平呈下降趨勢，這與本研究結果一致。然而，在T2DM背景下，血清CTRP9水平與不同發展階段DR的相關性研究鮮有報道。本研究結果顯示，與NPDR組相比，PDR組患者血清CTRP9水平降低(P<0.05)，提示CTRP9與DR的嚴重程度有一定的相關性，即隨著血清CTRP9水平降低，DR的嚴重程度增加，提示血清高水平CTRP9對于DR可能是一種保護因素。一項關于小鼠的體內研究表明，CTRP9過表達可降低空腹胰島素水平和空腹血糖，增加胰島素敏感性[13]。另有研究表明，CTRP9過表達可抑制細胞氧化應激和凋亡的發生[14]，可在一定程度上阻止DR的發展。此外，一項關于視網膜色素上皮細胞的研究報告發現，CTRP9除了有抗炎、抗氧化的作用，還可以改善視網膜的葡萄糖代謝、保護血管[15]。

本研究發現，與非DME組相比，DME組患者血清CTRP9的水平降低，差異有統計學意義(P<0.001)。DME的發病機制復雜，涉及大量炎性因子和炎性介質，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是引起DME的重要內源性介質，其過度產生可促使視網膜內皮細胞增殖和白細胞遷移，增加血管通透性，導致液體滲漏和視網膜新生血管形成[16]。研究表明，抗VEGF藥物治療可改善DME患者黃斑灌注狀態并提高視力[17]，是DME的臨床一線治療方法。一項動物實驗研究通過將表達CTRP9的腺病毒載體靜脈注射到12周齡的db/db小鼠中發現，CTRP9可以平衡VEGF的表達[18]，提示CTRP9可能與VEGF的表達有關，但二者間的關系還需更多研究論證。此外，CTRP9還可抑制db/db小鼠血-視網膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的分解和緊密連接蛋白的下調，研究人員通過免疫熒光染色和實時定量PCR檢測Claudin-5、Occludin和ZO-1等緊密連接蛋白的水平評估CTRP9對BRB完整性的影響，結果顯示，與正常對照組相比，DR組Claudin-5、Occludin和ZO-1等緊密連接蛋白的mRNA水平顯著降低[18]，表明CTRP9可通過防止緊密連接蛋白的丟失保護BRB的完整性，從而抑制DME的發生發展。

CTRP9作為一種新型脂肪因子，在脂代謝的調節方面也發揮著一定的作用。汪化文等[19]發現，冠狀動脈鈣化患者血清CTRP3、CTRP9水平與部分血脂指標水平具有明顯相關性，與TC、TG水平呈負相關，與HDL-C水平呈正相關。一項關于金銀花調節血糖和血脂水平的研究指出，CTRP3/9-AdipoR1-AMPK通路對保護性脂質(甘油二酯、HDL-C)具有一定保護作用[20]。雷升云[21]采用不同濃度CTRP9刺激巨噬細胞發現，CTRP9可顯著減少巨噬細胞內脂質沉積，同時還證明CTRP9可促進巨噬細胞內膽固醇流出相關蛋白的表達及膽固醇的流出。上述研究提示CTRP9與脂代謝產物有一定的相關性。本研究中Spearman秩相關性結果顯示，T2DM及DR患者血清CTRP9水平與脂代謝產物無顯著相關性，其他關于DR患者血清CTRP9的相關研究中也暫未發現其與脂代謝產物的相關性，分析原因可能與患者服用了降糖降脂藥物有一定關系。

然而，本研究顯示，隨著血清CTRP9水平降低，DR與DME的患病風險顯著增加，但CTRP9具體通過何種機制參與DR及DME的發生與發展，還有待進一步探討。目前認為，CTRP9可通過激活幾種信號通路發揮改善胰島素敏感性、降低血糖、減輕炎癥反應、抗氧化應激及保護血管內皮的作用。Zuo等[22]研究顯示，CTRP9可激活AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、蛋白激酶B(Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，從而調節血清胰島素及葡萄糖水平。Jung等[10]研究顯示，CTRP9通過激活脂聯素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB信號通路，下調腫瘤壞死因子-α、黏附分子及趨化因子的表達，減輕血管炎癥。此外，CTRP9還可通過激活AMPK/核紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)信號通路，減弱高血糖誘導的視網膜色素上皮細胞中的氧化應激和細胞凋亡的發生[15]。上述研究結果表明，CTRP9與T2DM及DR的發生發展密切相關。

隨著醫療水平及檢測技術的提高，目前多數DR患者可通過早期診斷與及時干預有效避免視力嚴重下降。因此，尋找相應的分子標志物對DR及DME的早期診斷、預防或干預具有重要意義。本研究中，Logistic回歸分析結果顯示，血清CTRP9水平是影響DR及DME發生的危險因素，提示CTRP9未來有可能成為預防和治療DR及DME的功能靶點。Zhang等[23]發現，gCTRP9作為CTRP9的亞型，對AMPK、Akt和內皮一氧化氮合酶的激活作用比CTRP9更強。因此，促進gCTRP9的產生可能是增強CTRP9生物學功能的有效途徑。后續將進一步研究CTRP9與DR及DME有關的潛在機制，可能有助于預防或延緩其進展并探索新的治療策略。

綜上所述，血清CTRP9水平降低是DR及DME發生的危險因素，其可能成為臨床上監測T2DM患者并發DR及DME的潛在參考指標，為預防或延緩DR及DME的發生提供參考。由于本研究是小樣本橫斷面研究，因此僅初步推斷CTRP9在預測DR及DME的發生發展方面具有一定價值，未來還需進行多中心、大樣本的臨床研究加以證實。另有研究發現糖尿病腎病是影響DR發生的危險因素[24]，本研究未能排除糖尿病腎病的影響。此外，由于T2DM患者病程較長，且多數患者服用降糖、降脂、保護神經等藥物，因此CTRP9與血管并發癥之間的關聯可能受到藥物等相關混雜因素的影響。