沱江流域水體抗生素殘留對微生物多樣性的影響及生態風險評估

向省維， 巫明毫， 張 力， 劉海鯊， 陳雪珂， 劉 玲，郭義東， 林家富， 宋 濤， 鄭德志， 沙菁洲

(1. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610052; 2. 涼山彝族自治州第一人民醫院藥劑科，四川 西昌 615000; 3. 四川省生態環境科學研究院，四川 成都 610046; 4. 四川省固體廢物與化學品管理中心，四川 成都 610032;5. 成都大學藥學院，四川 成都 610052)

0 引 言

現代化發展和人口增長導致各類污染物進入河流水體，而抗生素是其中最典型的污染物之一[1,2]。藻類、原生生物和微生物在水環境生態系統物質循環中發揮著重要作用。然而，水體中殘留的抗生素會對水生生物造成毒性、改變水體微生物群落結構和功能，造成水體生態系統退化，影響整個水體環境的物質循環[3-5]。

據報道，我國河流水體抗生素平均檢出濃度為303 ng/L[3]。水體抗生素殘留極易引起水生生物的毒性作用，如阿莫西林和氨芐西林對藻類產生毒性作用的最低濃度分別為3.7 ng/L[4]和0.31 ng/L[5]。而四環素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素[6]對地表水體沉積物中的菌群多樣性影響尤為顯著。細菌群落結構的改變可能影響生物地球化學循環和水生生態系統[7]。

沱江位于四川盆地中部，流經德陽和成都等7座大中型城市，經瀘州注入長江。流域內人口密度大，冠絕四川境內其他河流。而目前沱江流域抗生素殘留的研究較少，且主要集中于污染狀況、時空分布和風險評估等方面，至今未有殘留抗生素對水體微生物多樣性及其群落結構影響相關的研究。本文以沱江流域內6個國控/省控考核斷面為研究對象，探究水體中15種典型抗生素的殘留狀況，評估抗生素所造成的生態風險，并依托高通量測序技術分析水體微生物群落多樣性及群落結構特征，分析了殘留抗生素濃度與微生物群落多樣性之間的關系，為沱江流域抗生素類污染物的治理與防控提供一定的基礎數據和參考意見。

1 材料方法

1.1 材料與設備

儀器：UPLC-MS/MS（島津A-30/ABSciex Qtrap 3200）、分析天平（上海精天電子儀器有限公司）、循環式真空水泵、十二孔固相萃取裝置、超聲儀、渦旋儀、氮吹儀和臺式酸堿pH計（上海Jipad公司）。

試劑：甲醇/乙腈（色譜純）、甲酸（色譜級純）、超純水、NA2EDTA（分析純）、氫氧化鈉溶液、濃硫酸（分析純）和超純水等。抗生素標品購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99%。分析過程中所使用的各類試劑均符合國家標準。

材料：纖維玻璃濾膜（0.22 μm和 0.45 μm規格）、Oasis HLB小柱（6 mL 200 mg/500 mg waters公司 US）、色譜柱（Athena C-18-WP，100 A，2.1×150 mm，3 μm）、容量瓶（10 mL；50 mL；250 mL）、15 mL離心管、5 mL注射器和5 L容量聚乙烯水桶。

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 樣品采集

采樣點選取：依據《“十三五”四川省地表水環境質量監測點位分布圖》中的四川省監測斷面和國控考核斷面選取采樣點，采樣點的詳細信息見表1。

表1 采樣點具體信息

樣品采集：分別在監測點進行采樣，采樣位置分別為河流兩岸及河中心，采集水樣為江面表層水（深度為0～50 cm），所有水體樣本均采集三份，其中用于抗生素殘留測定的樣品，用4 mol/L硫酸調節pH值至3.0，并加入終濃度為5%的甲醇（V甲醇：V水），抑制細菌生長（用于微生物DNA提取的水樣不作該處理）。水體樣品處理和保存按照《水質采樣樣品的保存和技術管理規定》進行[8]。

1.2.2 水樣處理

水樣前處理：取水樣500 mL，先用水系玻璃纖維濾膜過濾，然后加入0.5 g NA2EDTA。基于固相萃取法（SPE）富集水體中抗生素：分別用10 mL甲醇和 10 mL超純水活化 HLB小柱[9]，以 5～10 mL/min進行上樣，使用25 mL5%甲醇水（V甲醇∶V水）潤洗取樣容器，再次上樣。使用10 mL超純水沖洗HLB小柱，去除雜質。

樣品洗脫與保存：將富集抗生素后的HLB小柱通過減壓真空處理120 min，以去除柱體內殘余水分。用6 mL甲醇，緩慢洗脫，收集洗脫的甲醇溶液，使用氮吹儀吹干，加入60%甲醇水（V甲醇∶V水）定容至 1 mL ，震蕩儀200 r/min震蕩 20 min，0.22 μm有機相濾膜過濾，貯存于棕色進樣瓶中，避光保存于-20 ℃。

1.3 分析方法

1.3.1 高通量測序方法

將采集的2 000 mL水樣通過0.45 μm纖維玻璃膜進行減壓真空抽濾，每個采樣點的樣品抽濾4份。將截留有水體微生物的纖維玻璃膜裝于15 mL離心管中，液氮冷凍保存，并送至北京諾禾致源生物科技有限公司進行16S rDNA高通量測序。

1.3.2 抗生素殘留分析方法

本文使用前期建立好的方法[10]對樣品進行分析。液相條件：Athena C18-WP色譜柱（2.1×150 mm,3 μm）；進樣量：5 μL；流動相流量：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0 min 20%B, 4 min 40%B, 6 min 100%B, 7 min 100%B, 7.5 min 20%B, 9 min 20%B。質譜條件：UPLC-MS/MS采用多重反應模式，ESI電離子源；干燥氣流量和溫度為6 mL/min和325 ℃；鞘氣流量為11 L/min；電離電壓2.5 kV；霧化器壓力 45 psi（1 psi=9.895 kPa）。

1.3.3 數據分析與統計方法

使用Origin 2018制作抗生素殘留柱狀圖、抗生素風險等級的熱圖和α-多樣性指數柱狀圖；OUT水平上的稀釋曲線圖、微生物群落占比柱狀圖由諾禾致源生物科技有限公司處理提供；抗生素-微生物占比冗余分析圖使用CANON 5軟件制作；SPSS Statistics 22軟件比較數據均值，并進行抗生素與微生物群落組成與α-多樣性指數之間的相關性分析。

1.4 抗生素殘留環境風險評價方法

依據歐盟指導文件中相關環境風險評估方法[11]，通過風險熵值法對水環境中抗生素殘留的生態風險熵RQEcotox(Risk Quotient of Ecotoxicity)進行評估，假設風險評估中抗生素之間作用不存在“協同作用”或“拮抗作用”。公式如下：

式中：MEC——環境中污染物實際檢出質量濃度；

PENCEcotox——環境生態毒性的預測無效應濃度。

其 中 RQEcotox＜0.1 為 低 風 險 范 圍 ；0.1≤RQEcotox＜1 為中等風險范圍；RQEcotox≥1 為高風險范圍。本文所用于評估的PENCEcotox數據如表2所示。

表2 抗生素初級生產者毒理數據與PENCEcotox1） μg/L

2 結果與討論

2.1 水體抗生素殘留濃度分析

對沱江流域6個監測點位（YSZ、JXC、HDDK、LJS、BJ和SHM）進行了抗生素殘留分析（圖1）。BJ和SHM及LJS 3個中上游監測點抗生素殘留水平較低，除 OTC、TE、CTX、CEX、AMX、NOR和CTC等7種抗生素未檢出外，其余8種抗生素均有檢出，濃度在 0.72 ～32.2 ng/L之間，除 CAP（32.20 ng/L）濃度較高以外，其余抗生素檢出濃度均低于15 ng/L。3個監測點位累計殘留濃度在9.29～76.88 ng/L，與王若男[19]等的研究結果相符，低于我國河流平均檢出水平[20]。

圖1 沱江流域監測點位抗生素殘留量

沱江中游的YSZ監測點共檢出7種抗生素，其中 NOR（61.30 ng/L）、MOX（54.81 ng/L）、ENR（24.80 ng/L）和 CAP（33.98 ng/L）為主要殘留抗生素，其余3種抗生素濃度低于10 ng/L。FQs是該點位的主要抗生素類型。下游2個監測點位中，JXC監測點除 TE、AMP、SMZ、SD、CTX和 CTC未檢出外，其余9種抗生素均有檢出，濃度在3.1 ng/L-179.9 ng/L之間。其中 OTC（179.90 ng/L）、CEX（88.65 ng/L）、AMX（16.64 ng/L）、NOR（39.04 ng/L）和CAP（25.23 ng/L）等抗生素檢出濃度較高。JXC監測點是沱江流域抗生素檢出濃度最高的點位。HDDK監測點除AMP和CTX未檢出外，其余13種抗生素均有檢出，濃度在4.62～79 ng/L之間，累計殘留濃度 411.9 ng/L。其中OTC（52.86 ng/L）、TE(62.47 ng/L)、ENR（48.80 ng/L）和MOX（74.00 ng/L）是主要的殘留抗生素。沱江下游HDDK和JXC兩個監測點人用和獸用抗生素均有檢出，且殘留濃度水平相對較高，比長江重慶段[21]稍高。TCs是本研究中檢出濃度最高的一類抗生素，而TCs是我省獸用領域使用量最大的一類抗生素之一[22]，與本次探究結果相符。

沱江流域共14種抗生素檢出，濃度在0.71 ～177.98 ng/L之間，抗生素累計濃度在 76.88～486.32 ng/L之間，總體比漢江干流[23]稍高，而比黃河[24]、九龍江[25]干流稍低。沱江水體抗生素污染總體呈階梯狀，上游至下游水體抗生素檢出濃度逐漸增加。沱江上游流經工業城市-德陽和成都市邊緣區縣-金堂縣，抗生素消耗產業相對較少，3個監測點位檢出濃度相對較低。沱江下游所在的資陽、內江、自貢和瀘州人口密集，畜禽養殖、水產養殖和醫療企業等抗生素使用量較大的企業分布較廣。處于中下游3個點位（YSZ、JXC和HDDK）抗生素檢出濃度較高，受污染程度稍重，LEV、ENR、NOR、CLI、MOX和CAP等抗生素均有檢出。LEV、CLI和MOX是臨床上常用的抗生素，該類殘留可能來源自醫療廢水；ENR和NOR是畜禽養殖上治療或預防腸道感染和作為促生長劑的常用抗生素；CAP廣泛應用于動物諸多疾病的防治，該3種抗生素可能來自養殖廢水。JXC和HDDK等下游監測點位檢出濃度高，附近流域可能存在污染源，應當予以重視。值得一提的是，我國2016年在獸用藥物領域禁止了NOR等抗生素的使用，而中下游3個點位均檢出，提示該區域內畜禽養殖企業可能存在違規用藥的問題。水體中人用和獸用抗生素均有檢出，沱江受城市廢水和畜禽養殖廢水污染的可能性較大。

2.2 水體殘留抗生素所致的生態風險

采用風險熵值法對沱江流域6個監測點位殘留抗生素引起的生態風險進行評估，RQEcotox范圍在0-6.74。除BJ和SHM外，其余4個監測點位處于高風險水平（圖2）。其中，LJS監測點AMP（RQEcotox4.59）檢出濃度處于高風險狀態；YSZ監測點AMP（RQEcotox6.74）和 NOR（RQEcotox3.06）檢出濃度處于高風險狀態；JXC監測點AMX（RQEcotox4.49）和NOR（RQEcotox1.95）檢出濃度處于高風險狀態；HDDK監測點 TE（RQEcotox1.03）、AMX（RQEcotox4.25）和NOR（RQEcotox1.71）檢出濃度處于高風險狀態。4個監測點位殘留抗生素對水生生物造成毒性作用的可能性大。15種抗生素中共有4種處于高環境風險等級，NOR是HDDK、JXC和YSZ三個監測點位的主要生態風險因子；TE僅在HDDK監測點表現為高風險。AMP（＜2.1 ng/L）和 AMX（＜17 ng/L）檢出濃度低，但卻為4個監測點的主要生態風險因子。相反，檢出濃度最高的CTC（177.98 ng/L）處于中等風險水平，AMX和AMP對沱江水生生物的毒性作用更顯著。我國河流檢出抗生素RQEcotox基本在10-3～102數量級之間[19,26-30]相比，沱江流域水體RQEcotox處于中等水平。

圖2 沱江水體抗生素風險等級

2.3 沱江水體微生物群落結構與多樣性

2.3.1 微生物α多樣性分析及空間分布差異特征

通過高通量測序技術分析沱江水體中微生物多樣性結構狀況，檢測到有效序列共427 824條，平均每個樣品為17 826條。物種稀釋曲線隨橫坐標趨向平緩（圖3），從側面說明本次測序的合理性。

圖3 沱江水體微生物在OUT水平上的稀釋曲線

通過α-多樣性指數顯示（圖4），24個樣本中Goods coverage指數均大于0.98，說明本次微生物測序結果真實可靠。平均物種指數在YSZ點位最高，為2 141.75，在JXC點位最低，為1 850.5。香農指數和辛普森指數分別在BJ和YSZ監測點最高，二者在HDDK監測點最低。Chao1指數在SHM最高，為2 956.12，在YSZ最低，為2 323.16。上游、中游和下游Species指數存在顯著性差異（p＜0.05）。沱江流域4個微生物多樣性指數（Species指數、Shanoon指數、Simpson指數和Chao1指數）均高于白洋淀[31]和南部海洋和濕地[32]的報道。

圖4 微生物多樣性系數分布圖

2.3.2 沱江流域微生物群落結構分析

通過高通量測序技術分析了沱江水體中的微生物群落結構（圖5），其微生物主要包括：變形菌門（Proteobacteria，20.08%～60.91%） 、 擬 桿 菌 門（Bacteroidota，6.97%～34.63%） 、 放 線 菌 門（Actinobacteriota，13.06%～28.64%）、藍細菌門（Cyanobacteria，0.44%～34.53%） 、 厚 壁 菌 門（Firmicutes， 0.35%～6.51%） 、 浮 霉 菌 門（Planctomycetota，0.15%～9.71%） 、 疣 微 菌 門（Verrucomicrobiota，0.35%～2.82%）、酸桿菌門（Acidobacteriota，0.09%～0.24%）、彎曲桿菌門（Campilobacterota，0.19%～0.69%）。 變形菌門在BJ監測點占比最高（60.91%），在HDDK監測點占比最低（20.08%）；擬桿菌門在SHM監測點占比最高（34.63%），在HDDK占比最低（6.97%）；放線菌門在YSZ監測點占比最高（28.64%），在BJ監測點位占比最低（13.06%）；藍細菌門在HDDK監測點占比最高（34.53%），在SHM監測點占比最低（0.44%）。

圖5 沱江水體微生物群落結構

水體中變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為優勢種群，與申立娜[33]在白洋淀的研究結果相似。通過上游、中游和下游監測點樣本的微生物（門水平）占比進行方差分析，發現沱江水體中放線菌門、疣微菌門和酸桿菌門分布的具有統計學差異（p＜0.05）。總體來看，沱江流域上、中、下游水體少部分的微生物占比存在差異，但差異較小。中游區域微生物多樣性和豐富度最高，該區域有九曲河、球溪河和蒙溪河等大小河流匯合，且資陽和內江段人口稠密，養殖業發達，這可能與該區域有機質污染（如氮、磷和有機質等），水體富營養化有關。

2.3.3 沱江水體抗生素殘留與微生物群落結構的相關性

本文以水體抗生素殘留量為環境變量，微生物多樣性指數為物質變量進行Spearman相關性分析，探究抗生素殘留對菌群多樣性的影響。結果得到，AMP[0.849Species（p＜0.05）]與 Species指數呈顯著性正相關。 TE[-0.978Simpson（p＜0.01）]、 AMX[-0.887Simpson（p＜0.05）]、SD[-0.971Simpson（p＜0.01）]和 CTC[-0.969Simpson（p＜0.01）]與 Simpson 指數呈顯著負相關性；AMP[-0.898Coverage（p＜0.05）]和 CAP[-0.832Coverage（p＜0.05）]與 Coverage指數呈顯著負相關性。除AMP外，其余4種抗生素對微生物多樣性指數均呈負相關趨勢。磺胺類對Simpson指數呈顯著負相關性與王美研究結果[34]相符。同時多類研究結果[35-36]表明喹諾酮類抗生素對Chao1指數呈正相關性，對Shannon指數呈負相關性[33]，而本文未體現出類似結果，但與深圳河干流[35]研究結論相同。這可能是由于殘留抗生素和其他的環境因子（有機質、重金屬、總磷和總氮等）共同作用，使河流不同段位微生物群落多樣性存在差異。

2.3.4 沱江水體抗生素殘留與微生物群落結構的相關性

本文以抗生素殘留量為環境變量，微生物群落結構（門水平）為物質變量進行RDA冗余分析，以探究抗生素對微生物群落結構的影響（圖6）。通過蒙特卡洛檢驗，選擇了解釋率較高的四類微生物作為分析對象，其中軸1解釋了44.61%的環境變量，軸2解釋了26.82%的環境變量，合計解釋變量71.43%。其中LEV和SMZ對酸桿菌門和疣微菌門呈現顯著的負相關性；AMX、AMP和OTC對浮霉菌門和藍細菌門呈現顯著的正相關。TE[0.981藍細菌門（p＜0.01） ，0.992浮霉菌門（p＜0.01）]、SD[0.978藍細菌門（p＜0.01），0.897浮霉菌門（p＜0.05）]和CTC[0.972藍細菌門（p＜0.01），0.999浮霉菌門（p＜0.01）]對浮霉菌門和藍細菌門有顯著的相關性；SMZ（[-0.936疣微菌門（p＜0.01），-0.920酸桿菌門（p＜0.01）]）、CLI[-0.894疣微菌門（p＜0.05），-0.918酸桿菌門（p＜0.05）]、MOX[0.951疣微菌門（p＜0.01），0.850酸桿菌門（p＜0.05）]和 CAP[0.817疣微菌門（p＜0.05），0.934酸桿菌門（p＜0.01）]對疣微菌門和酸桿菌門有顯著的相關性，其余微生物與抗生素之間無顯著性關系。

圖6 抗生素殘留水平-微生物群落占比冗余分析

抗生素在水體中可以通過多種途徑抑制或殺死微生物，也可以直接或間接改變微生物群落。有學者研究結果發現TE與OTC對微生物群落顯示正相關性[37]，磺胺二甲基嘧啶能長期影響土壤微生物群落結構和組成[34]，與本研究中磺胺類和TE類分析結果相印證。通過上述結果可得，不同種類抗生素對微生物群落影響的影響存在差異，而本文結果與艾比湖[38]研究相似，β-內酰胺類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類抗生素對微生物群落結構有較大影響。

3 結束語

本文對沱江流域六個省監測斷面和國控考核斷面水體樣本中抗生素殘留種類及殘留濃度進行測定，并基于高通量測序的手段分析了抗生素殘留對水體微生物多樣性的影響。沱江流域抗生素檢出濃度在0.71 ～177.98 ng/L，與全國河流相比總體處于普通水平。中游和下游區域抗生素檢出濃度上游區域檢出濃度遠高于上游，受污染程度稍重，這可能受城市廢水和養殖廢水污染的可能性大。中游和下游河段監測點處于高生態風險狀態，殘留抗生素對水生生物造成毒性作用的可能性較大。AMX、AMP和NOR三種抗生素是主要生態風險因子。高通量測序分析表明，β-內酰胺類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類抗生素對多類微生物群落結構影響顯著。本研究結果為研究水體抗生素殘留及生態風險評估，提供了一定的理論基礎，同時為有關部門制定完善醫療機構和養殖企業廢污排放相關政策，降低抗生素的排放提供了一定理論支撐。

由于沱江流域跨度較大，本文未對選定的監測點位進行長期動態監測分析。后續工作中，可以通過動態監測的方式分析水體抗生素殘留的季節性變化規律。同時，由于目前尚無抗生素在極低濃度下的藥理學參數和模型，風險熵值法評價抗生素所致的生態風險具有一定的局限性。環境抗生素殘留會引起細菌耐藥性的產生，將細菌耐藥性作為重要的參數引入水體抗生素引發的耐藥風險評估中，量化水體抗生素誘發環境細菌產生耐藥性的閾值濃度及動態變化規律，是今后環境抗生素殘留風險評估中的重要方向。