淺藍霉素H產生菌CRM05的發酵條件優化及其抗菌活性研究

高諭康?劉培培?李燕楠?邱培菊?朱偉明

摘要：目的 優化海洋來源的藍灰異壁放線菌OUCMDZ-413突變株CRM05的發酵條件，提高淺藍霉素H的發酵產量并測定其對海洋環境病原細菌的抑菌活性。方法 探索培養基組成、接種量、種齡、發酵天數、鹽度、pH、碳源、氮源、前體以及大孔吸附樹脂添加量，再采用單因素實驗和正交實驗確定最優發酵條件。結果 優化后淺藍霉素H的最佳發酵條件為：搖瓶發酵11 d（28℃、180 r/min）、裝液量150/500 mL（體積分數）、優化培養基（20 g可溶性淀粉、10 g 蛋白胨、10 g 酵母浸膏、4 g NaCl、4 g CaCO3、0.1 g 2-吡啶甲酸、40 g XAD-16大孔吸附樹脂、1 L 陳海水、滅菌前用1 mol/L鹽酸調節pH 6.5）、2%接種量、5 d 種齡（即菌落的A600 2.72）。結論 以優化條件發酵菌株CRM05，淺藍霉素H的分離產量達到434 mg/L，是優化前液體發酵產量的10倍和優化后固體發酵產量的1.6倍。淺藍霉素H可顯著抑制3種海洋弧菌—溶藻弧菌、創傷弧菌和副溶血弧菌，其最小抑菌濃度分別為8、16和16 μg/mL，活性強于環丙沙星（相應的最小抑菌濃度分別為64、64和32 μg/mL）。

關鍵詞：發酵優化；淺藍霉素H；抑菌活性；海洋環境病原細菌；突變株CRM05

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Fermentation optimization for the caerulomycin H-producing strain CRM05 and the antibacterial activity of caerulomycin H

Gao Yukang， Liu Peipei， Li Yan nan， Qiu Peiju， and Zhu Weiming

（ Key Laboratory of Marine Drugs， Ministry Education of China， School of Medicine and Pharmacy，

Ocean University of China， Qingdao 266003）

Abstract Objective To optimize the fermentation conditions for the caerulomycin H-producing strain CRM05 mutant from the marine-derived Actinoalloteichus cyanogriseus OUCMDZ-413 that we previously numbered as WH1-2216-6， and then assay the antibacterial activity against the pathogenic bacteria in the marine environment. Methods The optimal composition of the culture medium， inoculum size， inoculum age， cultivation time， salinity， pH， carbon sources， nitrogen sources， precursor， and additive amount of XAD-16 macroreticular resin were investigated by means of the single factor experiment， and the orthogonal experiment. Results The highest production of caerulomycin H was obtained through the liquid fermentation at 28℃ and shaking 11 d（180 r/min） in a 500 mL conical flask containing 150 mL of an optimized medium and 2% inoculation volume with 5d-old strain CRM05（A600 2.72）. The optimized medium was prepared by dissolving soluble starch 20 g， peptone 10 g， yeast extract 10 g， NaCl 4 g， CaCO3 4 g， and 2-pyridinic acid 0.1 g in 1 L of natural seawater with pH 6.5 （adjusted by 1 mol/L HCl）， and then adding 40 g of XAD-16 resin. Conclusion? ? The isolation yield of caerulomycin H reached 434 mg/L after optimization， which is respectively 10- and 1.6-folds increase in the yields of the previous unoptimized liquid fermentation and the optimized solid fermentation. In addition， caerulomycin H showed stronger inhibitory activity than ciprofloxacin（a positive control） against three marine vibrio strains， Vibrio alginolyticus， V. vulnificus and V. parahaemolyticus with the minimum inhibition concentrations of 8， 16 and 16 μg/mL for caerulomycin H and 64， 64 and 32 μg/mL for ciprofloxacin， respectively.

Key words Fermentation optimization; Caerulomycin H; Antibacterial activity; Marine pathogenic bacteria; Mutant strain CRM05

特殊環境微生物比如耐酸和海洋微生物由于其處于酸性環境[1]或含鹽環境中[2]，可產生結構獨特的、多樣化的次級代謝產物即天然產物[3]，由此成為藥物先導化合物的重要來源[4]，特別是海洋放線菌[5]。據統計，1976–2022年間分別報道了313個抗菌活性[6]和254個腫瘤細胞毒活性[7]的海洋放線菌新天然產物。淺藍霉素類化合物（caerulomycins）是來源于放線菌的一類具有2，2'-聯吡啶母核的生物堿，具有成為抗腫瘤藥物先導化合物乃至候選新藥的潛力[8]，其中最早發現并鑒定結構的是caerulomycin A[9]。前期從海洋來源的藍灰異壁放線菌（Actinoalloteichus cyanogriseus） 菌株OUCMDZ-413的發酵產物中分離鑒定了包括caerulomycins A和H在內的系列淺藍霉素類化合物，其中caerulomycin H對急性白血病細胞株HL-60表現出良好的細胞增殖抑制活性（IC50為1.6 μmol/L）[10-11]，且為caerulomycin A的生物合成前體[12-13]。為了獲得充足的caerulomycin H來進行成藥性研究，通過基因敲除滅活OUCMDZ-413的O-甲基轉移酶CrmM、構建了突變株CRM05，將生物合成阻斷在caerulomycin H[14]；然后初步優化了caerulomycin H的發酵條件，使其固體發酵的產量達到272 mg/kg[15]，仍有優化的空間。鑒于淺藍霉素類化合物的抗菌活性鮮有報道，而菌株OUCMDZ-413來自海洋，本文進一步優化了突變株CRM05生產caerulomycin H的發酵條件，并測試了caerulomycin H對8種海洋環境病原細菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

CRM05為藍灰異壁放線菌Actinoalloteichus cyanogriseus OUCMDZ-413（即WH1-2216-6） 的O-甲基轉移酶CrmM缺失的突變株[13]，8種海洋環境病原細菌：遲緩愛德華菌Edwardsiella tarda ATCC15947、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus ATCC14579、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC17802、創傷弧菌Vibrio vulnificus ATCC27562、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus ATCC33787、鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii ATCC19606、產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes ATCC13048、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792，保藏于本實驗室-80℃冰箱內。

1.1.2 儀器與試劑

天平（ME204，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲儀（VC750，Sonics公司）；超凈工作臺（MCV-131 BNF（T）型，sanyo公司）；恒溫搖床（ZHWY211B，上海智誠分析儀器制造有限公司）；潔凈工作臺（Air Tech，蘇州安泰空氣技術有限公司）；便攜式pH計（FiveGo2，梅特勒-托利多儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（LDZX-75KBS，上海愛寶醫療器械有限公司）；旋轉蒸發儀（N-1100型，EYELA公司）；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿有限公司）；冷凍干燥機（EZ-DRY型，美國FTS公司）；分析用高效液相色譜儀（島津公司，Shimadzu LC-6AD型號， SPD-M10Avp檢測器，YMC-pack ODS-A C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 μm， 12 nm， 1 mL/min）；液-質聯用儀（Wasters公司，Q-TOF Ultima Global GAA076 LC型）；三用紫外儀（ZF-6型，上海嘉鵬科技有限公司）；紫外光譜儀（DU640型，美國Beckman公司）；紅外光譜儀（Nicolet NEXUS 470型，美國Nicolet公司）；酶標儀（SpectraMax plus型，美國Molecular公司）；柱色譜與薄層色譜硅膠（200-300目，青島海洋化工集團）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；XAD-16大孔吸附樹脂（美國AMBERLITE公司）；高效薄層色譜板（GF 254，青島海洋化工廠）。

發酵所用的可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、豆粉、天冬氨酸、丙酸鈉以及各類無機鹽購自國藥集團；蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浸膏購自北京雙旋微生物培養基制品廠；瓊脂購自Solarbio公司；2-吡啶甲酸購自麥克林公司；液相色譜以及液質聯用甲醇和乙腈均為色譜純；常規提取分離用二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、冰醋酸、三乙胺均為工業用化學純產品。

1.1.3 培養基

除非特別指明，所有培養基均用1 L陳海水（即放置7 d的天然海水）配制，固體平板培養基系在相應液體培養基基礎上、加20 g瓊脂倒板而成。

（1）平板培養基（突變株CRM05的傳代、培養以及暫時保藏）

平板培養基的組成（g/L）：可溶性淀粉 20、甘油 20、蛋白胨20、KNO3 1、CaCO3 2、瓊脂 20（pH 7.5）。

（2）基礎發酵培養基（突變株CRM05的發酵培養）

高氏Ⅰ號（g/L）：可溶性淀粉 20、KNO3 1、K2HPO4·3H2O 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.5（pH 7.5）。

A1（g/L）：可溶性淀粉 10、酵母浸膏 4、蛋白胨 2、KBr 0.1、Fe2（SO4）3·4H2O 0.04（pH 7.5）。

放線菌1號（g/L）：淀粉 10、葡萄糖 20、牛肉浸膏 1、蛋白胨 20、酵母浸膏 4、豆粉 5、K2HPO4·3H2O 0.5、CaCO3 2（pH 7.0）。

放線菌2號（g/L）：可溶性淀粉 10、葡萄糖 20、牛肉浸膏 3、蛋白胨 10、酵母浸膏 10、CaCO3 2、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.5（pH 7.5）。

放線菌3號（g/L）：玉米浸膏 5、酵母浸膏 2、豆粉 5、（NH4）2SO4 2、可溶性淀粉 15、CaCO3 2（pH 8.0）。

放線菌4號（g/L）：可溶性淀粉 15、豆粉 5、甘油 15、蛋白胨 15、CaCO3 2（pH 7.5）。

放線菌5號（g/L）：可溶性淀粉 20、豆粉 15、酵母浸膏 5、蛋白胨 2、NaCl 4、CaCO3 4（pH 7.5）。

M3（g/L）：胰蛋白胨 2、天冬氨酸 0.1、甘油 5、丙酸鈉 4、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO4·3H2O 0.5、MgSO4·7H2O 0.1（pH 7.0）。

自制1號（g/L）：可溶性淀粉 20、蛋白胨 20、甘油 20、KNO3 1、CaCO3 2（pH 7.5），用于制作菌株CRM05種子液。

自制2號（g/L）：可溶性淀粉 20、蛋白胨 10、酵母浸膏 10、NaCl 4、CaCO3 4、2-吡啶甲酸 0.1、XAD-16大孔吸附樹脂 40（pH 6.5）。

（3）病原菌培養基

2216E培養基（g/L）：蛋白胨 10、酵母浸膏 5（用于培養遲緩愛德華菌、蠟狀芽胞桿菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌）。

LB培養基（g/L，自來水配制）：胰蛋白胨 10、NaCl 5、酵母浸膏 5（用于培養鮑曼不動桿菌、產氣腸桿菌、蘇云金芽胞桿菌）。

1.2 方法

1.2.1 菌株CRM05的發酵

將保藏于-80℃冰箱的菌株CRM05接種到自制1#培養基瓊脂平板上，放置28℃培養箱倒置培養

6 d。經傳代后挑取平板上的放線菌孢子接種到自制1#液體培養基中（150/500 mL三角瓶），于恒溫搖床（28℃、180 r/min）培養4 d，得到種子液。取種子液以2%的添加量接種到不同發酵條件的液體培養基中（150/500 mL三角瓶），于恒溫搖床（28℃、180 r/min）培養10 d得到發酵液。

1.2.2 菌株CRM05次級代謝產物的提取

將菌株CRM05的發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并減壓濃縮至干；若為添加了大孔吸附樹脂的發酵液則先用紗布和濾網過濾出樹脂，再使用等發酵液體積的丙酮沖洗大孔吸附樹脂3次，合并有機相并減壓濃縮至干。得到菌株CRM05在不同發酵條件下的粗提物，用于后續LC-MS定量分析。

1.2.3 Caerulomycin H的分離與提純

將粗體物經正相減壓硅膠柱色譜分離，以體積比為1：0、100：1、50：1、30：1、20：1、10：1、5：1、1：1、0：1的二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，將其中體積比為20：1、10：1和5：1的洗脫液合并，再經LH-20凝膠柱色譜分離（甲醇洗脫）得到高純度caerulomycin H [10]。

1.2.4 Caerulomycin H的定量檢測

Caerulomycin H的純度檢測：Caerulomycin H的純度經薄層色譜TLC檢測，其在展開劑（10：1：0.1二氯甲烷-甲醇-冰醋酸， V/V）、3種顯色方法（254 nm UV、香草醛-濃硫酸、碘顯色）下均呈現單一斑點。然后通過LC-MS驗純，即通過面積歸一法，選取5個不同的波長（λmax 210、242、256、280、302 nm）測定，記錄色譜圖的時間寬度為caerulomycin H出峰時間的2倍以上。結果顯示，在選取的5個不同波長下，caerulomycin H的純度均大于98%，符合標準品的純度要求[16-17]。

Caerulomycin H的標準曲線繪制：以上述純度大于98%的caerulomycin H為標準品，將其依次配成濃度為1、0.75、0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.005 mg/mL的甲醇（MeOH）溶液，然后進樣（1 μL）作LC-MS分析（流動相：9% MeCN/H2O + 0.1% HCO2H，流速：0.4 mL/min，檢測波長：λmax 242 nm），再通過面積歸一法檢測不同濃度的caerulomycin H對應的峰面積，繪制caerulomycin H的濃度（縱坐標）-峰面積（橫坐標）標準曲線（圖1）。

1.2.5 發酵條件優化及粗提物提取

按照“1.2.1”和“1.2.2”中的方法得到不同發酵條件的粗提物，將其配成濃度為2 mg/mL的甲醇溶液，進樣1 μL作LC-MS，檢測λmax 242 nm下峰面積、通過圖1標準曲線定量分析其中caerulomycin H的產量。在此基礎上，通過單因素實驗和正交實驗相結合的方式，探究基礎培養基、接種量、發酵時間、種齡、鹽度、pH、碳源、氮源、前體添加濃度和XAD-16大孔吸附樹脂添加量對caerulomycin H產量的影響，以此獲得caerulomycin H的最佳發酵條件。

1.2.6 抑菌活性測試

菌懸液制備：將遲緩愛德華菌、蠟狀芽胞桿菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌接種于2216E培養基中，鮑曼不動桿菌、產氣腸桿菌、蘇云金芽胞桿菌接種于LB培養基中，裝液量均為30/100 mL，置于28℃、180 r/min搖床培養12 h、以菌液渾濁作為培養終點，然后用對應的無菌培養基（即0.22 μm無菌濾膜過濾后的空白培養基）稀釋1000倍備用。

測試液制備：用細胞級的二甲基亞砜（DMSO）將caerulomycin H和陽性藥（環丙沙星）配成濃度為1.28 mg/mL的原液，備用。

最小抑菌濃度（MIC）測定：采用微量稀釋法、在96孔板中測定caerulomycin H和環丙沙星的MIC[18]。實驗分為空白組（僅加入空白培養基）、陰性組（稀釋的菌懸液和細胞級的DMSO）、藥物組包括陽性藥組（稀釋的致病菌液和不同濃度的環丙沙星）和化合物組（稀釋的致病菌液和不同濃度的caerulomycin H），每組平行設置3個復孔。藥物組中每孔加入10 μL caerulomycin H或環丙沙星原液、90 μL對應空白培養基和100 μL稀釋菌液，即每孔藥物濃度為64 μg/mL（初篩）；然后采用二倍梯度稀釋法測定MIC，用對應的空白培養基依次將藥物終濃度稀釋為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。加藥結束后，將96孔板放入37 ℃培養箱中培養12 h觀察每孔中液體的濁度，菌液由渾濁變澄清的第一個梯度即為藥物的MIC值。

2 結果與分析

2.1 Caerulomycin H標準曲線的繪制

按照“1.2.4”中標準曲線的繪制方法，分別以caerulomycin H的濃度和對應的峰面積為縱、橫坐標，繪制了caerulomycin H的標準曲線（圖1）。結果表明caerulomycin H的標準曲線為：y=0.0219x+ 0.0013、r2=0.9999（x為峰面積、y為濃度），曲線的線性關系良好，可用于caerulomycin H含量的測定[17，19]。

2.2 基礎培養基的確定

不同培養基的成分影響微生物對于營養的利用，從而影響微生物的次級代謝產物。將5 d種齡的CRM05種子液以2%的接種量分別接種到裝有150 mL放線菌1～5號、M3、A1和高氏1號（G1）液體培養基的500 mL三角燒瓶（搖瓶）中，放置于28℃、180 r/min的恒溫搖床培養10 d，每組實驗設3個平行。采用“1.2.2”的方法獲得含caerulomycin H的粗提物，LC-MS定量分析并通過標準曲線計算caerulomycin H的產量。結果表明：在8種培養基中，放線菌5號培養基培養時caerulomycin H產量最大（圖2）。因此以放線菌5號為基礎培養基進行下一步的發酵優化。

2.3 單因素實驗確定接種量、發酵時間、種齡、鹽度和初始pH值

2.3.1? ? ?接種量的確定

接種量對菌株次級代謝產物有一定影響。為了確定最佳接種量，分別向裝有150 mL放線菌5號培養基的500 mL搖瓶中接入體積比為1%、2%、3%、4%、5%、6%的種子液（種齡4 d），每組實驗設3個平行，其他條件不變。定量分析表明（同“2.2”）：當接種量為2%時，caerulomycin H的產量最大（圖3左）。

2.3.2 發酵時間的確定

發酵時間會影響菌株次級代謝產物及其產量。為了確定caerulomycin H的最佳發酵時間，在其他條件不變的情況下，搖床發酵培養CRM05菌株7、8、9、10、11和12 d，每組實驗設3個平行。結果表明：發酵7 d和8 d時菌落數較少、生長狀態不佳，發酵9～12 d時菌株生長狀態較好、且無明顯區別，但發酵11 d的caerulomycin H產量最大（圖3右）。

2.3.3? ? 種齡的確定

種子液的活力與種齡直接相關。接入的種子液活力旺盛則可以縮短發酵周期，提高發酵效率。在探究種齡對caerulomycin H產量的影響時，首先繪制不同種齡的種子液的生長曲線，結果表明：菌株CRM05在4～9 d進入穩定期，可用作種子（圖4左）。分別接種種齡為4、5、6和7 d的種子液，每組實驗設3個平行、其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結果表明：種齡為5 d時，caerulomycin H的產量最大（圖4右）。

2.3.4鹽度的確定

鹽度對于微生物的次級代謝產物也有重要影響，尤其是對于生存在高鹽環境中的海洋微生物。配制放線菌5號培養基時將鹽度分別調成0.4%（自來水配制，5#培養基成分中含0.4% NaCl）、2.4%（陳海水加自來水稀釋）、3.7%（陳海水）、4.4%、6.4%和8.4%，后3個鹽度是在陳海水的基礎上添加NaCl配制；其他條件不變。定量分析操作同“2.2”，結果表明：鹽度為6.4%和8.4%時菌株生長狀態很差，鹽度為3.7%即陳海水配制時，caerulomycin H的產量最大（圖5左）。

2.3.5 初始pH值的確定

酸堿度對菌株的正常生長及其次級代謝產物的產生十分重要，合適的pH可能會增加產物的產量。滅菌前用濃度為1 mol/L的HCl和NaOH將放線菌5號培養基的pH分別調整為4.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0，其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結果表明：當初始pH為4.0時，菌株無法正常生長；初始pH為6.5時，caerulomycin H的產量最大（圖5右）。

2.4 確定最佳碳、氮源及其配比

2.4.1 單因素剔除實驗

微生物對不同碳、氮源的回收利用有所不同，不同碳、氮源也會影響微生物次級代謝產物的產量。為了探究不同的碳、氮源對caerulomycin H產量的影響，首先設計了單因素剔除實驗。分別配制逐一剔除其中單個碳源（可溶性淀粉）、氮源（豆粉、蛋白胨、酵母浸膏）和無機鹽（NaCl和CaCO3）的放線菌5號培養基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結果表明：碳源中可溶性淀粉的影響最大，氮源中酵母浸膏的影響最大，單因素剔除無機鹽對caerulomycin H產量的影響較小（圖6）。

2.4.2 不同碳源對caerulomycin H產量的影響

分別以相同質量的甘油、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖和蔗糖替代可溶性淀粉配制培養基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結果表明：仍然是可溶性淀粉作為碳源時caerulomycin H的產量最大，甘油、麥芽糖和甘露糖次之；葡萄糖作為碳源時caerulomycin H產量最小（圖7左）。

2.4.3 不同氮源對caerulomycin H產量的影響

分別以相同質量的牛肉浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨和味精替代酵母浸膏配制培養基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結果表明，酵母浸膏作為氮源時caerulomycin H的產量最大，蛋白胨次之，味精作為氮源時caerulomycin H產量最小（圖7右）。

2.4.4 正交實驗確定培養基中碳源、氮源的最佳配比

從上述單因素實驗確定了培養基中最優的碳、氮源依然是5#培養基中的原始成分，進一步通過正交實驗確定其最佳配比[20]。將培養基中4種碳、氮源為研究對象，設計4因素3水平L9（34）正交實驗（表1），配制相應的培養基，按2.2方法培養菌株CRM05并計算caerulomycin H的產量。結果表明：按極差大小決定因素的影響順序，影響從大到小的順序依次為B（豆粉）、A（可溶性淀粉）、D（蛋白胨）、C（酵母浸膏）；確定最優組合為A2B1C2D3，即2%可溶性淀粉、1%酵母浸膏和1%蛋白胨（表2）。

綜上，最優培養基組合為：20 g可溶性淀粉、10 g酵母浸膏、10 g蛋白胨、4 g NaCl、4 g CaCO3、1 L陳海水（滅菌前用1 mol/L鹽酸調節初始pH 6.5）。

2.5 前體和大孔吸附樹脂添加量對caerulomycin H產量的影響

2.5.1 添加2-吡啶甲酸前體

添加適量前體利于微生物次級代謝產物的產生。2-吡啶甲酸是淺藍霉素類化合物的生物合成前體[12]，有必要探究添加不同量的2-吡啶甲酸對caerulomycin H產量的影響。為此，將濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mg/mL的2-吡啶甲酸加入到最優培養基中，其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結果表明：當2-吡啶甲酸的添加量≤0.4 mg/mL時，有利于提高caerulomycin H的產量，其中添加量為0.2 mg/mL時caerulomycin H產量最大（圖8左）。

2.5.2 添加XAD-16大孔吸附樹脂

大孔吸附樹脂是近年來使用較多的有機吸附劑[21]，

因大孔吸附樹脂成本低、可再生以及吸附性好等優點，被廣泛應用于工業級的微生物發酵。為了探討XAD-16大孔吸附樹脂是否可以富集并提高caerulomycin H的產量，本文設計向上述優化的培養基中分別添加質量分數為0、2%、4%、6%、8%和10%的XAD-16大孔吸附樹脂，其他條件不變。按照“1.2.2”的操作提取得到粗提物，再按照“2.2”方法定量分析。結果表明：大孔吸附樹脂的添加明顯提高caerulomycin H的產量，其中XAD-16添加量為2%時caerulomycin H產量最大（圖8右）。

2.5.3 確定XAD-16大孔樹脂和2-吡啶甲酸的最佳添加比

由于XAD-16樹脂和2-吡啶甲酸前體的添加對caerulomycin H產量有較大影響，考慮到實驗的可操作性與工作量，分別選取3個最佳條件通過全面交互實驗來探究二者的最佳添加比。根據“2.5.1”和“2.5.2”的實驗結果，在“2.4”確定的最優培養基條件下，設定XAD-16樹脂的3個添加水平為2%、4%、6%（質量分數），2-吡啶甲酸前體的3個添加水平為0.1、0.2、0.4 mg/mL，按照表3進行正交實驗（其他發酵條件不變），并通過“2.2”方法測定caerulomycin H的產量。結果表明：在最優培養基條件下，XAD-16樹脂和2-吡啶甲酸前體的添加量分別為4%（即40 mg/mL）和0.1 mg/mL時caerulomycin H產量最大（圖9）。

2.6 最優發酵條件驗證

根據上述實驗結果，總結出菌株CRM05生產caerulomycin H的最優發酵條件為：配制最佳培養基（20 g可溶性淀粉、10 g酵母浸膏、10 g蛋白胨、4 g NaCl、4 g CaCO3、0.1 g 2-吡啶甲酸、40 g XAD-16樹脂、1 L 陳海水、滅菌前1mol/L HCl調節pH 6.5），裝液量150/500 mL、接種量2%（種齡5 d）、置于28℃和180 r/min下搖床發酵11 d；利用該條件共發酵8瓶（8×150 mL=1.2 L）。發酵完成后過濾除去發酵液，將吸附產物的XAD-16大孔吸附樹脂裝柱，以體積比為0、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、9：1、10：0的乙醇-水各500 mL依次洗脫。合并其中含caerulomycin H的3：7和4：6（V/V） 乙醇-水洗脫液（薄層色譜TLC檢測）、減壓濃縮除去乙醇后，水相用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮乙酸乙酯后得到的固體，所得固體經15 mL 乙酸乙酯和5 mL甲醇依次洗滌后、置于60 ℃下用甲醇重結晶，得到521.3 mg純度≥98%的caerulomycin H（即434.4 mg/L），是優化前液體發酵產量（42.4 mg/L）[15]的10.2倍和優化固體發酵產量（272 mg/kg） [15]的1.6倍。

2.7 Caerulomycin H的抑菌活性

初篩結果表明caerulomycin H在濃度為64 μg/mL時對8種致病菌均有抑菌活性，故采用微量肉湯稀釋法進一步測定其對8種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）。結果表明（表4），caerulomycin H對8種致病菌的MIC值為8～64 μg/mL；其中對溶藻弧菌（VA）、創傷弧菌（VV）和副溶血弧菌（VP）的抑菌活性強于陽性藥環丙沙星（ciprofloxacin），尤其是對溶藻弧菌的活性最顯著、MIC值為8 μg/mL（環丙沙星MIC為64 μg/mL），

值得深入研究。

3 結論

Caerulomycin H對人腫瘤細胞株HL-60和A549具有較好的細胞增殖抑制活性[10]，同時也是重要的合成中間體，因其結構的4-位羥基可進行糖基化等修飾得到糖苷等caerulomycin H的衍生物[15]。因此，本文通過單因素實驗和正交實驗等方法探究了培養基組成等不同發酵條件對caerulomycin H產量的影響，獲得了caerulomycin H的最佳發酵條件。優化后caerulomycin H的分離產量達到434 mg/L，比之前優化的固體發酵產量[15]提高了60%、是優化前液體發酵產量的10倍，為其后續結構修飾與成藥性研究奠定了化合物基礎。鑒于淺藍霉素類化合物的抑菌活性鮮有報道，本文還首次發現caerulomycin H對3種海洋弧菌即溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、創傷弧菌Vibrio vulnificus和副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus具有顯著的抑菌活性，可深入探究。

參 考 文 獻

王乂， 樊亞琴， 王亞楠， 等. 耐酸微生物的酸脅迫天然產物[J]. 中國抗生素雜志， 2017， 42（4）： 255-260.

郭躍偉. 海洋天然產物和海洋藥物研究的歷史、現狀和未來[J]. 自然雜志， 2009， 31（1）： 27-32.

朱偉明， 王俊鋒. 海洋真菌生物活性物質研究之管見[J]. 菌物學報， 2011， 30（2）： 218-228.

朱偉明. 海洋天然產物的高效發現與成藥性研究[J]. 中草藥， 2019， 50（23）： 5645-5652.

Fenical W， Jensen P R. Developing a new resource for drug discovery： Marine actinomycete bacteria[J]. Nat Chem Biol， 2006， 2（12）： 666-673.

Wang C， Lu Y， Cao S， et al. Antimicrobial compounds from marine actinomycetes[J]. Arch Pharm Res， 2020， 43（7）： 677-704.

Qiu Z， Wu Y， Lan K， et al. Cytotoxic compounds from marine actinomycetes： sources， structures and bioactivity[J]. Acta Mat Med， 2022， 1（4）： 445-475.

梅顯貴， 藍萌萌， 金言正， 等. 天然來源的淺藍霉素類化合物[J]. 中國海洋藥物， 2017， 36（5）： 83-92.

Funk A， Divekar P V. Caerulomycin， a new antibiotic from Streptomyces caeruleus Baldacci. Ⅰ. Production， isolation， assay， and biological properties[J]. Can J Microbiol， 1959， 5（4）： 317-321.

Fu P， Wang S， Hong K， et al. Cytotoxic bipyridines from the marine-derived actinomycete Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6[J]. J Nat Prod， 2011， 74（8）： 1751-1756.

Mei X， Lan M， Cui G， et al. Caerulomycins from Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6： isolation， identification and cytotoxicity[J]. Org Chem Front， 2019， 6（20）： 3566-3574.

Zhu Y， Fu P， Lin Q， et al. Identification of caerulomycin a gene cluster implicates a tailoring amidohydrolase[J]. Org Lett， 2012， 14（11）： 2666-2669.

Fu P， Liu P， Li X， et al. Cyclic Bipyridine glycosides from the marine-derived actinomycete Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6[J]. Org Lett， 2011， 13（22）： 5948-5951.

Zhu Y， Zhang Q， Li S， et al. Insights into caerulomycin A biosynthesis： A two-component monooxygenase CrmH-catalyzed oxime formation[J]. J Am Chem Soc， 2013， 135（50）： 18750-18753.

羅云， 高諭康， 燕鵬程， 等. 淺藍霉素H的發酵優化與淺藍苷K的化學合成[J]. 有機化學， 2022， 42（9）： 2840-2849.

劉強， 王立平， 王聰， 等. PurpurquinoneA的發酵條件優化[J]. 中國抗生素雜志， 2016， 46（4）： 247-254.

王聰， 劉培培， 王乂， 等. 海洋來源放線菌Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554產放線菌素D的發酵條件優化[J]. 中國海洋藥物， 2014， 33（3）： 34-42.

Yin S， Liu Z， Shen J， et al. Chimeric natural products derived from medermycin and the nature-inspired construction of their polycyclic skeletons[J]. Nat Commun， 2022， 13（1）： 5169.

賈海健， 王聰， 王乂， 等. 海洋來源放線菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6 產淺藍霉素A的發酵條件優化[J]. 中國海洋藥物， 2014， 33（5）： 9-15.

羅朝亮， 韋開聽， 龍立活， 等. L9（34）正交試驗法優選黃芩解毒顆粒水提取工藝[J]. 中國藥業， 2022， 31（21）： 44-48.

王園， 鞠立逵. 基于大孔吸附樹脂的微生物制藥分離純化技術[J]. 化工與醫藥工程， 2022， 43（5）： 53-57.