糖尿病患者腸道定植肺炎克雷伯菌的分子流行病學特征

薛兆平 伊茂禮 徐衛皓 張玉梅

摘要：目的 了解糖尿病患者腸道肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）定植率、耐藥性以及分子流行病學特征。方法 收集煙臺某醫院內分泌科就診的糖尿病患者糞便，分離培養和鑒定KP，使用拉絲試驗測定其黏液表型，使用K-B紙片擴散法測定其耐藥性，通過全基因組測序分析其莢膜血清型、毒力基因和多位點序列分型。結果 收集145份糖尿病患者的糞便標本，檢出50株KP，檢出率為34.48%，檢出率在性別、糖尿病病程長短、血糖控制方面差異均無統計學意義。50株KP中高黏液表型菌株18株。檢出的KP菌株對大部分常用抗生素耐藥率較低。50株KP分析出26種血清型，其中K1血清型（20.00%，10/50）占比最高。K1血清型在高黏液表型KP中的比例（44.44%，8/18）明顯高于非高黏液表型KP（6.25%，2/32）。高黏液表型KP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb的攜帶率高于非高黏液表型KP。 多位點序列分型中分析出34種ST型，ST23檢出率最高（14.00%，7/50），且均為K1血清型。結論 煙臺地區糖尿病患者腸道中肺炎克雷伯菌當前定植率較高，耐藥率較低，高黏液表型KP攜帶更多的毒力基因，K1-ST23菌株已初步占優勢。

關鍵詞：糖尿病；肺炎克雷伯菌；耐藥性；分子流行病學

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Molecular epidemiological characteristics of intestinal colonization of Klebsiella pneumoniae in diabetic patients

Xue Zhaoping1，2 ，Yi Maoli2， Xu Weihao2， and Zhang Yumei1

（1 Binzhou Medical University， Yantai 264003; 2 Laboratory Center of Yantai Yuhuangding Hospital， Yantai 264000）

Abstract Objective To understand the colonization rate， drug resistance， and molecular epidemiological characteristics of Klebsiella pneumoniae （KP） in the intestinal tract of diabetic patients. Methods The stool samples of diabetic patients in the endocrinology department of a hospital in Yantai were collected， and Klebsiella pneumoniae were isolated， cultured， and identified. The mucus phenotype of Klebsiella pneumoniae was detected by string test， and its drug resistance was detected by K-B method. The capsular serotype， virulence gene and multilocus sequence typing were analyzed by whole genome sequencing. Results 145 stool samples from diabetic patients were collected， and 50 strains of Klebsiella pneumoniae were detected， with a detection rate of 34.48%. There were no significant differences in the detection rates concerning gender， length of diabetes duration， or glycemic control. 18 of 50 KP strains with intermediate to high mucoid phenotype. The detected KP strains were less resistant to most commonly used antibiotics. 50 KP strains were detected with 26 serotypes， among which the K1 serotype （20.00%， 10/50） accounted for the highest proportion. The proportion of K1 serotype in hypermucinous phenotype KP （44.44%， 8/18） was significantly higher than that in non-hypermucinous phenotype KP （6.25%， 2/32）. The virulent gene carrying rates of high mucus phenotype KP in all， arc， clb， fdr， fyu， glc， glx， hyi， iro， irp， iuc， iut， mce， rmpA， rmpA2， ybb， ybt and ylb were higher than that of non-high mucus phenotype KP. 34 types were separated out， the detection rate of ST23 was the highest （14.00%， 7/50） which were K1 serotypes. Conclusion Some diabetic patients in Yantai carry Klebsiella pneumoniae in their intestinal tract. The current drug resistance rate is low， and the high-mucus phenotype KP carries more virulence genes. K1-ST23 strain has been initially dominant.

Key words Diabetes; Klebsiella pneumoniae; Drug resistance; Molecular epidemiology

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）作為臨床微生物中檢出率較高的腸桿菌目條件致病菌，廣泛分布在自然環境中。健康人群的腸道和呼吸道等部位均有定植，在特殊情況下可導致醫院獲得性感染和社區獲得性感染，引起肝膿腫、眼內炎、肺炎和尿路感染等[1-3]。人體腸道是肺炎克雷伯菌最主要的儲存庫之一，其在人體腸道中的定植被認為是發生肺炎克雷伯菌腸外感染的關鍵風險因素[4]。糖尿病在世界范圍的流行形勢十分嚴重，可引起多種嚴重的并發癥。國際糖尿病聯盟在2021年發表的國際糖尿病流行病學報告統計表明，世界范圍糖尿病患病率約10.5%（5.366億人），并且在不斷增加。多項臨床研究表明糖尿病是肺炎克雷伯菌侵襲性感染的高危因素[5]，可引起化膿性肝膿腫等疾病。本文對煙臺某醫院于2021年4月—2022年3月就診的糖尿病患者糞便標本進行肺炎克雷伯菌的分離、培養和鑒定，以期了解該地區糖尿病患者腸道肺炎克雷伯菌的攜帶情況，耐藥性以及分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集煙臺某醫院2021年4月—2022年3月內分泌科就診的糖尿病患者糞便標本，糖尿病患者的診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標準[6]，患者采集前1個月內無抗菌藥物使用記錄，剔除重復就診采集的標本。

1.2 主要儀器與試劑

HERAcell240i型CO2培養箱（Thermo公司），HHWS-III-400型恒溫恒濕培養箱（上海躍進公司）， microflex LT/SH型質譜儀（Bruker公司）。

Mac-Conkey瓊脂平板、Golumbia Blood瓊脂平板和Mueller Hinton瓊脂平板（安圖生物公司） ，基質 （Bruker公司），藥敏紙片（Oxoid公司）

1.3 方法

1.3.1 培養和鑒定

將糞便標本接種于Mac-Conkey瓊脂平板，在35 ℃，7.5%CO2培養箱中培養18～24 h，對可疑菌落使用BRUKER質譜儀鑒定。

1.3.2 高黏液表型檢測

將篩查出的肺炎克雷伯菌菌落轉種在Golumbia Blood瓊脂平板35℃培養18～24 h，用接種環挑取菌落并向上拉起，即拉絲試驗（string test），如拉起的黏液絲長度≥5 mm，則為陽性，否則為陰性。拉絲試驗陽性的菌株為高黏液KP（hypermucoviscoid Klebsiella pneumoniae， HmKP）。

1.3.3 藥敏試驗

使用K-B紙片擴散法對12種常規抗菌藥物進行藥敏試驗（表1），根據美國臨床和實驗室標準化協會推薦的折點判讀細菌藥敏結果，獲得50株KP對該12種抗菌藥物敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）的結果。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.4 KP全基因組測序及組裝

將篩查出的肺炎克雷伯菌菌株送浙江天科高新技術發展有限公司進行測序組裝。應用Institut Pasteur（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）分析菌株的莢膜多糖血清型分型（K型）和毒力基因，應用MLST2.0（https：//cge.food.dtu.dk/services/MLST/）分析其多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）。

1.3.5 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析處理，通過率（%）和構成比（%）進行統計學描述，檢出率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出率

收集2021年4月—2022年3月煙臺某醫院內分泌科就診患者的145份糞便標本中，共檢出KP50株，總檢出率為34.48%（50/145）。其中男性患者78人，KP檢出率為33.33%（26/78）；女性患者67人，KP檢出率35.82%（24/67），差異無統計學意義（χ2=0.10，P=0.753）。糖尿病病程不超過1年中KP檢出率為28.13%（9/32），病程超過1年未超過10年中KP檢出率為35.85%（19/53），病程超過10年中KP檢出率為36.67%（22/60），差異無統計學意義（χ2=0.743，P=0.690）。糖化血紅蛋白≤7.0%患者中KP檢出率為16.67%（3/18），＞7.0%患者中檢出率為37.00%（47/127），差異無統計學意義（χ2=2.887， P=0.089）。本研究中1型糖尿病共5人，其中2人檢出腸道KP定植，2型糖尿病共140人，其中48人檢出腸道KP定植。

2.2 高黏液表型菌株

在檢出的50株肺炎克雷伯菌中，高黏液表型占36.0%（18/50），拉絲試驗見圖1。

2.3 藥敏試驗

本研究的50株肺炎克雷伯菌株，總體耐藥率較低，其中對復方磺胺甲惡唑耐藥率最高，為16.00%（8/50），其次為環丙沙星6.00%（3/50），對其余10種抗生素的耐藥率較低（≤2.00%）（表1）。其中1株肺炎克雷伯菌對阿莫西林/克拉維酸結果為中介，對頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢吡肟、環丙沙星和復方磺胺甲惡唑5種常見抗菌藥物均耐藥。

2.4 分子生物學特征分析

50株肺炎克雷伯菌中分析出26種血清型（表2），其中K1血清型20.00%（10/50），其次為K57型10.00%（5/50），K2、K9、K54、K63均為4.00%（2/50）。HmKP中44.44%（8/18）為K1血清型，非HmKP中6.25%（2/32）為K1血清型，高黏液表型KP中的K1血清型比例明顯高于非高黏液表型KP，差異有統計學意義（χ2=10.886，P=0.001）。本研究的50株KP中毒力基因mrk的檢出率為98.00%，HmKP與非HmKP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb攜帶率差異均有統計學意義，而毒力基因kvg、kfu和mrk的攜帶率差異均無統計學意義（表3）。50株肺炎克雷伯菌的MLST分型分析出34種ST型，其中ST23檢出率最高14.00%（7/50），且均為K1血清型，其次2株ST22均為K9型，2株ST111均為K63型，2株ST412均為K57。

3 討論

根據CHINET細菌耐藥檢測2021年的數據顯示，肺炎克雷伯菌已成為臨床分離菌株占比第二的致病菌[7]。有研究表明，腸道部位定植的KP與肝膿腫高度相關，早期發現糖尿病患者肺炎克雷伯菌腸道定植，可能有助于對感染患者做出早期干預治療[8-9]。因此，作為一種潛在的病原體，存在于腸道中的KP必須得到足夠的關注。本研究從收集的145例糖尿病患者糞便標本中檢出50株KP菌株，檢出率為34.48%（50/145），接近于范沁榕等[10]報道的35.00%，顯著高于Zhang等[11]報道的腹瀉患者中7.80%的檢出率，這可能與不同地區間的生活環境以及人群腸道菌群結構有關。該結果進一步證實了糖尿病患者腸道中存在KP，突顯了加強監測的重要性。同時，研究中發現不同病程的糖尿病患者腸道KP攜帶率差異無統計學意義。糖化血紅蛋白可以有效地監測糖尿病患者過去約12周的血糖平均水平，因此被用來作為反映長期血糖控制水平的指標，目前≤7.0%被廣泛視為糖尿病糖化血紅蛋白的控制標準[12]。本研究中糖化血紅蛋白控制良好的患者中KP檢出率16.67%，低于控制不達標患者37.00%檢出率，但差異無統計學意義。不足的是，本研究中絕大部分研究對象為2型糖尿病，各型糖尿病間的差異還需要大規模流行病學研究。

肺炎克雷伯菌根據其毒力和對抗菌藥物耐藥性的不同可分成兩大類，一大類是毒力低、耐藥率高為特點的經典KP（classic Klebsiella pneumoniae，cKP），另一大類是毒力高、耐藥率低為特點的高毒力KP（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HvKP）[13]。高黏液是HvKP最重要的特征之一，所以許多研究把拉絲試驗陽性的KP定義為HvKP，因為它會導致免疫力健全人群的社區獲得性感染，最容易引起肝膿腫，并因其高毒力導致較高的致死率。本研究中HmKP占36.00%，與Zhang等[14]研究的血流感染、醫院獲得性肺炎和腹腔內感染等綜合來源的37.8%相近，低于王麗萍等[5]報道腹腔感染單一來源的51.19%，可能是由于地區間差異，也可能是HmKP更容易侵入機體特定部位臟器導致，其原因還需要進一步驗證。

隨著當前抗生素的普遍應用，多重耐藥KP、耐碳青霉烯KP均有大量報道，對臨床抗菌方案的選用提出了巨大的考驗。但本研究中，KP對常見的抗菌藥物敏感性較高，可能跟本研究人群社區獲得性有關，與醫院獲得性的高耐藥率顯著不同，同時可能受地區耐藥率的影響。研究中僅發現一株對6種抗生素均不敏感的cKP，并通過全基因組分析，發現該菌株攜帶β-內酰胺類耐藥基因（blaCTX-M和blaSHV），喹諾酮耐藥基因（qnrS），磺胺類耐藥基因（sul1），外排泵基因（baeR、oqxA、emrR和marA）和膜孔蛋白基因（ompK37）等。

肺炎克雷伯菌已成為一個緊迫的公共衛生威脅，因此強有力的流行病學監測至關重要。此細菌產生的莢膜多糖是重要的毒力因子和流行病學標記物，全基因組序列為探索莢膜多樣性提供了前所未有的機會。目前有報道[15]可能多達134個不同的K型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57是HmKP的獨特K型。本研究中K1型占顯著優勢，其次為K57、K2、K9、K54、K63型，表明本地區糖尿病患者腸道攜帶的HmKP存在K1型優勢菌株，而cKP的K型分散明顯，未發現集中趨勢。毒力基因多位于染色體上，其編碼的毒力因子，是決定KP侵襲能力以及對抗菌藥物敏感性的重要因素，包括莢膜、脂多糖、鐵載體和菌毛等。本研究中的50株KP檢測到多種毒力基因并呈現多樣性，49株攜帶與菌株黏附相關的3型菌毛mrk基因，并發現HmKP與非HmKP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb的攜帶率差異均有統計學意義，HmKP可能攜帶更多毒力基因，導致多樣化的侵襲性感染。位于KP染色體上的kfu基因編碼相應蛋白，可以介導Fe3+的吸收從而增加KP毒力[16]，胡仁靜等[17]報道僅在K1血清型KP中檢出kfu基因，Lee等[18]對分離自肝膿腫患者的14株K2血清型KP的研究結果顯示，其中有35.7%的菌株攜帶該基因。與以往報道不同，本研究中不僅K1血清型攜帶kfu基因，K13、K49、K54、K57血清型也攜帶該基因。

同時，在抗生素壓力下，菌株由于適應性需求，高毒力高耐藥的肺炎克雷伯菌也出現越來越多的報道[19-20]。多位點序列分型是通過檢測核酸序列而劃分細菌類型的方法，可以較好地表現細菌地區進化過程和菌群生物學變化，可以分析不同ST型在一個區域內的局部傳播趨勢，有利于對細菌進行短期和長期的流行病學研究。本研究發現本地糖尿病患者腸道中ST23型KP占比最高，ST23是HmKp中的優勢菌株之一，值得注意的是，ST23與莢膜血清型K1緊密相關，這與中國東南部Zhang等[21]發現的化膿性肝膿腫中KP菌株的分子流行病學特征相一致，進一步支持了引起侵襲性肝膿腫的KP來源于腸道的觀點。一旦糖尿病患者免疫力降低或者腸道保護屏障損傷，KP便有可能逆行侵入門脈系統，引起肝膿腫或者遠處播散感染其他器官。同時本研究發現ST412與K57血清型緊密相關，與國內外報道臨床標本檢出KP中的發現相一致[17， 22]。此外本研究中ST22與K9血清型緊密相關，ST111與K63血清型緊密相關，但可能由于對非高毒力KP相關研究甚少，未發現相關報道，但這些發現都揭示了ST分型與莢膜血清型的緊密相關性。

綜上所述，煙臺地區糖尿病患者腸道中肺炎克雷伯菌當前定植率較高，耐藥率較低，高黏液表型KP攜帶更多的毒力基因，K1-ST23菌株已初步占優勢，有進一步傳播流行的可能性，應高度關注對糖尿病患者等易感人群的監測，以便預防肺炎克雷伯菌所引起的感染。

參 考 文 獻

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