頭孢洛林對革蘭陽性菌敏感性研究

鄭業煥 張影 李軼 張藝 方娟 付光宇

摘要：目的 通過頭孢洛林對臨床革蘭陽性菌的體外敏感性研究，為臨床頭孢洛林合理使用提供參考。方法 收集了491株臨床非苛養革蘭陽性菌，同時采用自動化系統和微量稀釋法對頭孢洛林進行體外藥敏試驗，采用統計學方法對兩種檢測方法進行一致性研究，分析革蘭陽性菌對頭孢洛林體外敏感性。結果 491株革蘭陽性菌最低抑菌濃度檢測結果中，用自動化系統和微量肉湯稀釋法測定的MIC值在±1個二倍稀釋倍數范圍內的有479株，超出此范圍的有12株菌，即基本一致性（EA，Essential agreement）為97.56%（479/491）。針對有CLSI折點的金黃色葡萄球菌敏感性分析，211株用自動化系統和微量稀釋法測定MIC值在±1個稀釋倍數的范圍內，有7株菌的MIC值超出了此范圍，即EA為96.70%（205/212）。1株菌藥敏解釋出現差異，即分類一致性（CA，Category agreement）為99.53%（211/212）。此外，統計分析顯示試劑盒檢測金黃色葡萄球菌對頭孢洛林的敏感率為96.70%（205/212），MRSA對頭孢洛林的敏感率為95.95%（71/74）。結論 在自動化儀器藥敏檢測中，頭孢洛林用于革蘭陽性菌的藥敏檢測結果精準穩定，與微量肉湯稀釋法的符合率達到97%以上，對MRSA的敏感率較高，一定程度上滿足臨床微生物實驗室藥敏檢測需求。

關鍵詞：頭孢洛林；革蘭陽性菌；藥敏；體外

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Research of sensitivity of ceftaroline to Gram-positive bacteria

Zheng Yehuan1， Zhang Ying1， Li Yi2， Zhang Yi3， Fang Juan1， and Fu Guangyu1

（1 Zhengzhou Autobio Diagnostics Co.， Ltd， Zhengzhou 450016; 2 Henan Provincial People，s Hospital， Zhengzhou 450003;

3? Zhengzhou central Hospital， Zhengzhou 450052）

Abstract Objective Through the study of the in vitro sensitivity of ceftaroline to clinical Gram-positive bacteria， it provides a reference for the rational use of ceftaroline in clinical practice. Methods A total of 491 clinical non-caustic Gram-positive bacteria were collected， and the in vitro susceptibility test of ceftaroline was carried out by automated system and micro-dilution method， and the consistency of the two detection methods was studied by statistical methods， and the sensitivity of Gram-positive bacteria to ceftaroline in vitro was analyzed. Results Among the 491 strains of parallel detection， 479 strains were determined by automated system and microdilution method in the range of ±1 dilution multiple， and the MIC values of 12 strains exceeded this range， that is， the basic consistency （EA， essential agreement） was 97.56% （479/491）. For the sensitivity analysis of Staphylococcus aureus with CLSI vertices， 211 strains were determined by automated systems and microdilution methods in the range of ±1 dilution multiple， and the MIC value of 7 strain exceeded this range， that is， EA was 96.70% （205/212）. One strain had inconsistent susceptibility results， namely 99.53% （211/212） of the Category agreement （CA）. In addition， statistical analysis showed that the sensitivity rate of Staphylococcus aureus to ceftaroline detected by the kit was 96.70% （205/212）， and that of MRSA to ceftaroline was 95.95% （71/74）. Conclusion In the automated instrumental susceptibility detection， the drug sensitivity test results of ceftaroline for Gram-positive bacteria were accurate and stable， and the coincidence rate with the micro broth dilution method was more than 97%， and the sensitivity rate to MRSA was high， which to some extent met the needs of clinical microbiology laboratory drug sensitivity test.

Key words Ceftaroline; Gram-positive bacteria; Antibiotics sensitivity; In vitro

革蘭陽性菌在自然界分布廣泛，存在于自然環境、人和動物的皮膚黏膜等部位，可引起多種局部化膿性或全身感染[1]。革蘭陽性菌種類較多，從全國細菌耐藥監測網2014-2019年間的統計數據來看，全部醫院檢出革蘭陽性菌排名靠前的五位分別為：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌和屎腸球菌[2]。

革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和腸球菌等）感染患者常用的抗生素選擇有青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、喹諾酮類等。其中，青霉素類為革蘭陽性球菌感染的首選抗生素，或第一、二代頭孢菌素用于抗感染治療。但由于青霉素酶的產生和作用靶位的改變等耐藥機制的出現和廣譜抗生素的使用，導致病原菌對抗生素的耐藥或多重耐藥率的增加，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌 （methicillin-resistant coagulase negative staphylococci，MRCNS）、耐萬古霉素的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等，因此尋找對多重耐藥革蘭陽性菌的有效治療藥物是當今抗感染藥物研究的熱點之一。

頭孢洛林（ceftaroline） 是頭孢洛林酯的活性代謝產物，由日本武田制藥研發的第五代頭孢菌素類抗生素，通過干擾細菌細胞壁發揮作用，用于治療細菌性肺炎、急性細菌性皮膚感染等。2010年美國食品藥品管理局（FDA）批準該藥上市，2012年在歐盟上市，目前在我國尚未上市，其抗菌譜廣，對大多數革蘭陽性菌（含MRSA、VRE等）和許多革蘭陰性菌及厭氧菌，都有較強的抗菌活性，而且副作用小[3]。本研究結合最新2020版CLSI M100-S30標準[4]，491株測試菌株分離自河南省人民醫院、鄭州市中心醫院臨床樣本，采用自動化儀器法進行頭孢洛林敏感性試驗，同時以微量肉湯稀釋法進行對比，為新抗菌藥物的藥效做出評價并為臨床上治療革蘭陽性菌感染及合理用藥提供一定的參考和指導。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

2020年2月—2020年11月本研究收集了河南省人民醫院、鄭州市中心醫院臨床常規分離的革蘭陽性菌株491株，包含腸球菌190株，芽胞桿菌30株，微球菌1株，金黃色葡萄球菌212株，其他屬葡萄球菌58株（溶血葡萄球菌14株，表皮葡萄球菌24株，中間葡萄球菌4株，人葡萄球菌4株，耳葡萄球菌3株，腐生葡萄球菌1株，路鄧葡萄球菌5株，模仿葡萄球菌1株，頭葡萄球菌2株）。質控菌株采用ATCC標準菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC29213）糞腸球菌（ATCC29212）均源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

頭孢洛林購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；革蘭陽性菌藥敏板（含梯度稀釋的頭孢洛林）和全自動微生物鑒定藥敏分析儀AutoMic-i600由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；Mueller-Hinton Broth （MHB）培養基購自BD醫療器械（上海）有限公司。

1.3 方法

革蘭陽性菌藥敏嚴格按照試劑盒說明書和儀器標準操作規程完成上機檢測；微量稀釋法的操作和判讀參照CLSI標準進行[5]：配制與頭孢洛林包被板卡標記濃度一致的濃度梯度稀釋液8～0.12 ?g/mL

（包含陽性、陰性對照孔），完成加樣后進行封閉處理，在35℃±1℃環境下孵育20～24 h，當陽性對照孔明顯渾濁時，觀察結果并記錄MIC值。

1.4 統計分析

統計自動化儀器法與微量肉湯法MIC結果，參考CLSI折點文件確定敏感程度。并統計2種不同方法檢測結果的EA（指測試方法與對比方法在±1個稀釋倍數范圍內的符合率）和CA（指測試方法與對比方法的藥敏解釋完全一致的符合率）[6-7]。

2 結果

2.1 質控菌株最低抑菌濃度檢測結果

本次質量控制參考CNAS-GL028臨床微生物檢驗程序驗證指南[8]，選用的2株ATCC標準菌株，每天重復測定3次，每次單獨制備接種物，連續測定5天，記錄藥物的MIC值，結果顯示藥敏板卡結果與微量稀釋法一致，均符合質控范圍要求，具體數據見表1所示。

2.2 樣本EA結果分析

共計491株革蘭陽性菌，479株用自動化藥敏儀器法和微量稀釋法測定MIC值在±1個2倍稀釋梯度范圍內。其中完全一致的有176株（176/491，35.85%），±1個稀釋倍數的有303株（303/491，61.71%）。超出了±1個2倍稀釋梯度的有12株菌，EA為97.56%（479/491），針對這12株菌經復測確認，有9株菌測定結果在±1個2倍稀釋梯度范圍內，即糾正后的EA為99.39%（488/491），結果見表2所示。

2.3 樣本CA結果分析

頭孢洛林僅對金黃色葡萄球菌有藥敏折點解釋標準，故有藥敏解釋的樣本共212例，且CLSI M100文件指出頭孢洛林對葡萄球菌的藥敏折點包括S、SDD、R，其中SDD是指劑量依賴性敏感。針對212株金黃色葡萄球菌用自動化藥敏和微量稀釋法測定，藥敏結果不一致的有1株，即分類一致性（CA，category agreement）為99.53%（211/212）（表3）。

2.4 CPT藥敏結果統計分析

使用革蘭陽性菌藥敏檢測試劑盒檢測頭孢洛林藥敏結果，整體敏感率為96.70%（205/212）；MRSA的敏感率為95.95%（71/74），具體結果見表4。

3 討論

抗菌藥物敏感性試驗是指對臨床組織樣本中分離的細菌進行體外抗菌藥物敏感性試驗，用于測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌的作用，旨在幫助臨床醫師選用效果最佳的藥物治療感染性疾病。目前，臨床微生物實驗室采用的抗菌藥物敏感性試驗方法主要有紙片擴散法、E-test法、肉湯稀釋法和自動化儀器法（即產品化的微量肉湯法）。其中，紙片擴散法通過測量抑菌圈來反應對測試菌株對抗菌藥物的敏感程度，該方法測得藥敏結果具有較好的重復性、效率較高，且試劑成本相對較低，因此是基層醫院開展藥敏試驗常用的一種方法。E-test法雖然可以檢測具體MIC值，但操作基本都是手工完成，E-test試條成本較高，藥物選擇種類有限也限制了其應用。肉湯稀釋法可分為宏量肉湯稀釋法和微量肉湯稀釋法，兩種方法的基本原理相同但操作較為繁瑣[7]。為了滿足臨床試驗需求，許多廠家生產了商品化的微量抗生素敏感試驗板（如BD Phoenix、Vitek-compact系統），簡化實驗步驟，抗生素種類豐富，更適合開展藥敏試驗。

頭孢菌素類藥物屬于β-內酰胺類抗生素藥物，是一類廣譜半合成抗生素，通過干擾繁殖期細菌細胞壁中肽聚糖的合成發揮殺菌消炎的作用。與青霉素類相比，頭孢菌素具有耐青霉素酶、不良過敏反應較少、毒性較低等優點，在呼吸道感染、泌尿系統感染等癥狀治療中發揮極其重要的作用[9]。但隨著獲得性耐藥和多重耐藥問題日趨嚴重，不斷壓縮臨床抗感染治療藥物的選擇空間，加大治療難度，因此研發抗菌譜廣、活性高的新型頭孢菌素是目前的研究熱點。第五代頭孢類藥物-頭孢洛林酯（Teflaro）于2010年10月通過美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，用于治療由MRSA引起的成人社區獲得性細菌性肺炎（CABP）、急性細菌性皮膚和軟組織感染（ABSSSI），這些潛在致命性感染急需新的治療方案[10-11]。第五代頭孢菌素的最大的臨床應用價值是治療多種病原菌混合感染。特別是有MRSA感染風險的混合感染，因為目前常用的抗MRSA的藥物為萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺[12]，而此類藥物常需要聯合其他藥物進行聯合治療，并可能有耳毒性、腎毒性和血小板減少等不良反應。五代頭孢的出現讓臨床醫師們單藥治療多種病原菌混合感染成為可能。該藥物對β-內酰胺酶穩定性較高，既能減少聯合抗菌素，又能降低抗菌藥的使用強度，還能讓重癥感染病人得到一個簡單卻沒有死角的抗感染治療的最佳選擇[13]。

頭孢洛林作為新型第五代頭孢菌素，在2010年美國上市之后相繼有不少研究學者對治療兒童急性細菌感染性疾病（主要包括CAP和SSSIS）的療效進行報道，美國醫療中心關于頭孢洛林對細菌病原體耐藥性五年監測項目中指出：頭孢洛林在≤2 μg /ml時對所有金黃色葡萄球菌均有抑制作用，對甲氧西林耐藥的菌株也具有較好的抗菌活性[14]。體外藥敏試驗中頭孢洛林對頭孢曲松耐藥肺炎鏈球菌和耐多藥肺炎鏈球菌均有較好的抑制作用[15]，劉岳峰等[16]檢索了2010年10月—2020年2月間發表在Pubmed、EMBASE、Cochrane Central Register of Controlled Trials、Medline、CBM、CNKI上的關于涉及關鍵詞“頭孢洛林、兒童、急性細菌感染”等的198篇報道，并對內容進行提取通過Meta分析得出結論：頭孢洛林治療兒童急性細菌感染性疾病的臨床療效和安全性較好。袁曉慶等[17]在對頭孢洛林的作用機制研究中指出頭孢洛林與青霉素結合蛋白具有高度親和力，對MRSA的最低抑菌濃度濃度明顯低于β-內酰胺抗生素，表明頭孢洛林在體外對MRSA有一定的抗菌活性。

本文通過對陽性球菌中的212株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗結果分析可見，安圖革蘭陽性菌藥敏檢測試劑盒中的頭孢洛林對金黃色葡萄球菌的敏感率可達到96.70%（205/212），其中對MRSA的敏感率達到95.95%（71/74）。通過文獻調研發現：Biedenbach等[18]研究的頭孢洛林可以抑制臨床分離的90.2% MRSA。Sader等[19]在2013年對2351株金黃色葡萄球菌藥敏結果進行了研究，發現對頭孢洛林的敏感率達到93.4%。與本文結果比較接近，此外Pfaller等[20]采用金標準微量肉湯稀釋法對6222株金黃色葡萄球菌對頭孢洛林的藥物敏感性進行了研究，發現敏感率可高達99.6%，對MRSA敏感率99.1%。進一步可以說明，本研究使用的方法得到的金黃色葡萄球菌的藥敏結果準確度較高。另外本文也匯總分析了全球各地對頭孢洛林的藥敏研究結果：其中美國地區頭孢洛林對金黃色葡萄球菌抑菌率98.2%，頭孢洛林對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）的抑菌率達100%[21]；中東和非洲國家在2015—2018年中從軟組織感染分離的MRSA菌株未發現頭孢洛林耐藥的現象[22]；在一項全球皮膚感染項目中關于頭孢洛林和頭孢他啶阿維巴坦對革蘭陽性菌和陰性菌的體外活性研究指出，從歐洲、亞洲/南太平洋、拉丁美洲、非洲/中東這些地區收集的7950株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）對頭孢洛林的敏感性高達99.6%，9174株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）分離株對頭孢洛林的敏感率同樣高達96.5%的比例[23]。

綜上可見全球不同地區針對頭孢洛林對金黃色葡萄球菌及MRSA敏感率的研究有微小區域差異性，但整體抑菌率比較接近，與本文金黃色葡萄球菌敏感率96.70%（MRSA敏感率95.95%）結論比較一致；更進一步展現了頭孢洛林對金黃色葡萄球菌較好的抗菌活性，為臨床陽性菌感染又添利器。

藥物敏感性試驗為臨床用藥、新藥研究、監測耐藥變遷、發現耐藥機制等提供客觀證據[24]，準確的藥敏試驗對于臨床選擇適當的抗微生物藥物非常關鍵[25]。本文中研究的頭孢洛林的結果顯示EA達到99.39%，CA達到99.53%。可見評價試劑與微稀釋方法有較高的一致性，可以為臨床體外藥敏試驗提供更多選擇。