BEZ235和順鉑協同抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲

陳康, 邢基, 張云龍, 程帆

膀胱癌是全球第十大常見腫瘤[1］, 發病率和病死率高[2］。膀胱癌90%為尿路上皮癌, 其中約75%為非肌層浸潤性癌, 25%為肌層浸潤性或轉移性膀胱癌[3］。非肌層浸潤性膀胱癌術后復發率高達70%, 可發展為肌層浸潤性膀胱癌, 肌層浸潤性膀胱癌預后差, 5年總生存率小于50%, 一次切除后易復發[4］。以順鉑為基礎的新輔助化療是局部晚期肌肉浸潤性膀胱癌的推薦療法[5］。然而, 大多數膀胱癌病人最終會產生順鉑耐藥性, 癌細胞會通過使凋亡因子失活并增強對抗凋亡信號的存活途徑而對化療產生抗性[6］。

隨著對腫瘤生物學認識的進步, 靶向治療已成為包括泌尿生殖系統腫瘤在內的各種惡性腫瘤的一線或二線治療選擇。此外, 越來越多的數據表明, 聯合使用靶向藥物是增強傳統化療抗腫瘤效果的一種很有前途的策略[7-8］。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號軸是一條主要的生存途徑, 其異常激活經常參與包括浸潤性膀胱癌在內的多種腫瘤的發生發展[9］。此外, 一些研究已經觀察到在腫瘤中, 抑制PI3K/AKT/mTOR通路可以增加順鉑的敏感性[10-11］。一些研究已經評估和證明了PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑在臨床前或臨床環境下對膀胱癌的抗腫瘤作用[12-13］。然而, 很少有研究詳細檢驗順鉑和PI3K/AKT/mTOR通路抑制抑制劑在人類膀胱癌中的協同作用。我們在2020年1月1日至2021年5月30日研究了口服生物利用咪唑喹啉衍生物PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ235協同順鉑對膀胱癌細胞的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料人膀胱癌5637細胞購自中國科學院上海生命研究所, RPMI-1640、胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自美國Hyclone公司, 其他化學品購自美國Corning公司, 抗體均購自美國Abcam公司。蛋白質印跡法化學發光試劑購自美國Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養在含10%胎牛血清（gibco）和青霉素-鏈霉素（100 U/mL）的RPMI-1640中, 在37 ℃, 5%二氧化碳的培養箱中培養。

1.2.2 細胞計數試劑盒（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法細胞活力測定 用96孔板按每孔2 000個細胞接種5637細胞, 在接種后24 h、48 h、72 h和96 h, 將CCK-8溶液按1∶10比例加入96孔板, 用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。細胞生存率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.3 聯合用藥指數（combination index, CI）的計算 采用 CompuSyn（1.0.1）軟件分析兩藥的CI, CI小于1表示兩藥協同, 等于1表示兩藥效相加, 大于1表示兩藥拮抗。

1.2.4 細胞劃痕和細胞侵襲試驗 當細胞在6孔板中達到90%融合時, 用200 μL的吸管尖端劃傷細胞層。劃痕的圖像是在0、24和48 h拍攝的。24 h后, 觀察相同位置的劃痕傷口愈合情況, 并比較空白組、正常對照組和siRNA組的愈合情況。通過測量多個位置的劃痕寬度, 計算劃痕傷口愈合的平均速率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬×100%。在細胞侵襲實驗中, 收集3 000個轉染的人膀胱癌細胞（5637細胞）并轉移到上transwell小室。上室加入200 μL RPMI-1640培養基, 下室加入600 μL完全培養基。48 h后用結晶紫染色, 熒光顯微鏡下觀察穿膜細胞數。

1.2.5 集落形成試驗 獲得藥物處理后的對數生長期的5637細胞, 將其中的500個均勻接種到六孔板中每兩天進行換液。隨后, 細胞常規培養10 d。當形成肉眼可見的細胞集落時, 取出平板, 然后用PBS沖洗細胞兩次, 并用甲醇固定15 min。廢棄固定液后, 用結晶紫染色, 計算細胞的集落形成數。

1.2.6 蛋白質印跡法 蛋白酶抑制劑（Beyotime：貝約提姆, 中國）以1∶100的比例加入到總蛋白提取試劑（Solarbio, 中國）中, 并與培養的細胞混合。BCA法用于測量蛋白質濃度。將蛋白質樣品與加載緩沖液混合, 并加載到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上進行蛋白質印跡法分析, 將電泳分離后的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上, 用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h；加入兔抗人上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經鈣黏素（N-cadherin）和波形蛋白單克隆抗體和鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）, 4 ℃反應過夜；等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次后加入二抗, 并在室溫下以1∶5000的濃度孵育1 h。TBST洗膜3次后, 免疫印跡帶使用電化學發光法（ECL）試劑盒（中國蛋白科技）進行可視化, 在Bio-Rad凝膠成像儀中觀察蛋白條帶。用Image Lab軟件分析蛋白條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學方法所有實驗至少進行3次。用SPSS 22.0軟件進行統計分析。定量數據以±s表示, 兩組間比較采用成組t檢驗的方法, 多組間數據比較采用單因素方差分析, 多組間兩兩比較SNK-q檢驗。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BEZ235和順鉑單獨或聯合使用對5637細胞活性的影響CCK-8法檢測BEZ235和順鉑對膀胱癌細胞增殖的抑制作用。用不同濃度BEZ235和順鉑處理5637細胞, 分別于0、1、2、3和4 d檢測細胞活力。如表1, 2所示, BEZ235和順鉑對5637細胞均以時間和劑量依賴的方式發揮抑制作用（均P＜0.05）。BEZ235和順鉑分別作用3 d后, 當5637細胞的生長抑制率為50%時, BEZ235和順鉑的濃度分別為98 nmol/L和1.1 μmol/L, 為了計算方便, 后續我們將使用100 nmol/L BEZ235和1 μmol/L順鉑進行實驗。隨后, 5637細胞分別經25、50、100和200 nmol/L BEZ235以及0.1、0.5、1.0和2.0 μmol/L順鉑聯合處理, 計算聯合用藥的CI值, 結果如表3所示, 當100 nmol/L BEZ235和0.1 μmol/L順鉑聯合用藥時, CI值最小, 即兩藥的協同作用最強。

表1 順鉑對膀胱癌細胞5637的影響/±s

表1 順鉑對膀胱癌細胞5637的影響/±s

注：①與0 μmol/L組相比,P＜0.05。②與0.1 μmol/L組相比,P＜0.05。③與1.0 μmol/L組相比,P＜0.05。

順鉑濃度0 μmol/L 0.1 μmol/L 1.0 μmol/L 5.0 μmol/L F值P值重復次數9 999細胞活性（490 nm處吸光度）24 h 0.31±0.03 0.29±0.04 0.28±0.03 0.26±0.02 1.37 0.32 48 h 0.58±0.05 0.56±0.03①0.49±0.04①②0.25±0.03①②③46.78＜0.001 72 h 1.03±0.06 0.95±0.04①0.52±0.03①②0.23±0.02①②③260.6＜0.001 96 h 1.35±0.05 1.31±0.03①0.47±0.03①②0.21±0.01①②③922.46＜0.001

表3 BEZ235和順鉑對膀胱癌5637細胞的聯合用藥指數

2.2 BEZ235聯合順鉑可協同抑制膀胱癌細胞的平板克隆形成BEZ235 和順鉑單藥及兩藥聯合處理 5637細胞后, 應用平板克隆形成實驗檢測細胞的集落形成能力。結果如圖1顯示, 集落形成數：對照組為（207±9）個, BEZ235單藥處理組為（146±10）個, 順鉑單藥處理組為（179±11）個, 兩藥聯合處理組為（103±9）個（F=76.81,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理的5637細胞集落形成數顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯合處理的5637細胞集落形成數顯著少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖1 平板克隆形成實驗檢測BEZ235和順鉑聯合或單藥對膀胱癌5637 細胞集落形成能力的影響

2.3 BEZ235聯合順鉑可協同抑制膀胱癌細胞的遷移能力BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理 5637細胞后, 應用劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力。結果見圖2, 細胞遷移率：對照組為（70±5）%, BEZ235單藥處理組為（52±6）%, 順鉑單藥處理組為（53±4）%, 兩藥聯合處理組為（39±6）%（F=17.17,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理的5637細胞的遷移率顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯合處理的5637的遷移率少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖2 劃痕愈合實驗檢測BEZ235和順鉑聯合或單藥對膀胱癌5637 細胞遷移能力的影響

表2 BEZ235對膀胱癌細胞5637的影響/±s

表2 BEZ235對膀胱癌細胞5637的影響/±s

注：①與0 nmol/L組相比,P＜0.05。②與10 nmol/L組相比,P＜0.05。③與100 nmol/L組相比,P＜0.05。

BEZ235濃度0 nmol/L 10 nmol/L 100 nmol/L 500 nmol/L F值P值重復次數9 9 9 9細胞活性（490 nm處吸光度）24 h 0.28±0.02 0.26±0.03 0.25±0.04 0.24±0.03 0.93 0.47 48 h 0.52±0.04 0.47±0.05①0.28±0.02①②0.25±0.02①②③44.57＜0.001 72 h 0.88±0.05 0.74±0.03①0.42±0.02①②0.26±0.01①②③275.38＜0.001 96 h 1.26±0.07 0.86±0.04①0.46±0.02①②0.25±0.01①②③342.33＜0.001

2.4 BEZ235聯合順鉑可協同抑制膀胱癌細胞的侵襲能力BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理5637細胞后, 應用transwell法檢測細胞的侵襲能力。結果如圖3顯示, 侵襲細胞數：對照組為（346±36）個, BEZ235單藥處理組為（193±38）個, 順鉑單藥處理組為（254±27）個, 兩藥聯合處理組為（133±23）個（F=24.81,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理5637細胞后, 穿過基質膜的細胞數顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯合處理組穿過基質膜的5637細胞數顯著少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖3 細胞侵襲實驗檢測BEZ235和順鉑聯合或單藥對膀胱癌5637 細胞侵襲能力的影響（結晶紫染色×200）

2.5 BEZ235和順鉑的聯合作用可調節膀胱癌細胞中上皮-間質轉化相關蛋白的表達BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理5637細胞后, 應用蛋白質印跡法檢測細胞中上皮-間質轉化相關的E-cadherin、Ncadherin和波形蛋白蛋白表達情況。結果如表4所示, BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯合處理5637細胞中E-cadherin蛋白表達水平均高于對照組（均P＜0.05）, N-cadherin和波形蛋白的表達水平均低于對照組均P＜0.05）。兩藥聯合處理組的5637細胞中 E-cadherin蛋白表達水平均顯著高于各單藥處理組（均P＜0.05）, N-cadherin和波形蛋白的表達水平均顯著低于各單藥處理組（均P＜0.05）。

表4 蛋白質印跡法檢測BEZ235和順鉑聯合或單藥對膀胱癌5637細胞中上皮-間質轉化相關蛋白N-cadherin、E-cadherin和波形蛋白表達的影響/±s

表4 蛋白質印跡法檢測BEZ235和順鉑聯合或單藥對膀胱癌5637細胞中上皮-間質轉化相關蛋白N-cadherin、E-cadherin和波形蛋白表達的影響/±s

注：N-cadherin為神經鈣黏素, E-cadheri為上皮鈣黏素。①與對照組相比,P＜0.05。②與BEZ235組相比,P＜0.05。③與順鉑組相比,P＜0.05。

組別對照組BEZ235順鉑BEZ235+順鉑F值P值重復次數9 9 9 9 N-cadherin 0.57±0.07 0.32±0.04①0.44±0.03①0.21±0.03①②③34.75＜0.001 E-cadherin 0.38±0.06 0.56±0.06①0.28±0.04①0.59±0.05①②③23.18＜0.001波形蛋白1.02±0.04 0.61±0.02①0.68±0.03①0.57±0.05①②③68.49＜0.001

3 討論

癌細胞的侵襲和隨后的轉移是導致死亡的主要原因[14］。許多研究表明, 與單一療法相比, 接受聯合療法的病人在治療腫瘤轉移等方面表現出良好的生存結果, 這使得聯合療法在癌癥治療方面有巨大潛力[15-16］。在很多腫瘤中, PI3K/Akt/mTOR通路被異常激活, 該通路抑制劑在不同腫瘤中被廣泛研究[17］。目前對晚期和轉移性尿路上皮膀胱癌病人的治療標準是基于順鉑的聯合化療, 但順鉑的耐藥性常限制了其使用[18］。

本研究通過CCK-8法驗證了BEZ235 和順鉑單獨用藥時能抑制膀胱癌5637細胞的增殖, 當不同濃度的BEZ235和順鉑聯用時, 多種濃度組合均表現為協同抑制作用, 當100 nmol/L BEZ235與0.1 μmol/L順鉑聯用時, 兩者的聯合用藥指數CI值最小, 表明此時兩者的協同作用能力最強。為了驗證BEZ235和順鉑的協同作用, 在接下來的實驗中, 我們使用100 nmol/L BEZ235與0.1 μmol/L順鉑單獨或者聯合作用于5637細胞。平板克隆形成的實驗結果顯示, BEZ235聯合順鉑可顯著抑制膀胱癌細胞的增殖。劃痕愈合實驗和細胞侵襲實驗顯示, BEZ235聯合順鉑可顯著抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。

為了探究BEZ235和順鉑協同抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的具體機制, 我們進一步研究了BEZ235和順鉑與上皮-間質轉化相關蛋白的潛在關聯, 例如上皮標志物：E-cadherin, 間質標志物：N-cadherin和波形蛋白。上皮-間質轉化是指上皮細胞失去極性而成為間質細胞的生物學過程, 上皮-間質轉化會賦予細胞轉移和侵襲能力, 使惡性腫瘤細胞具有轉移傾向[19-20］。E-cadherin蛋白表達與細胞的黏附力有關, E-cadherin蛋白的高表達能抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲[21］, 而N-cadherin和波形蛋白的高表達會促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[22］。本研究發現, BEZ235和順鉑兩藥聯合時可顯著抑制N-cadherin和波形蛋白的表達, 并能顯著上調E-cadherin的表達, 表明BEZ235聯合順鉑可通過上皮-間質轉化途徑抑制膀胱腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述, BEZ235和順鉑能夠抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲, 并且兩種藥物能夠協同通過上皮-間質轉化途徑抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲, 使抗腫瘤效果更為顯著。本研究為臨床膀胱癌病人的靶向治療提供了聯合用藥的實驗基礎, 也為解決順鉑在膀胱癌中的耐藥難題提供新的思路。