顱腦損傷病兒血清血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體、Toll樣受體4表達水平及臨床意義研究

王文召, 李娜, 劉一鳴

顱腦損傷是指由于外作用力沖擊導致的頭顱和腦損傷性疾病, 是導致殘疾和死亡的首要原因, 主要臨床表現為意識障礙、運動障礙、頭痛、嘔吐等。顱腦損傷可引起一系列病理生理過程, 因其復雜多變, 且易出現各種并發癥, 預后較差, 嚴重威脅人類生活質量和生命安全, 給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔, 因此, 尋找早期分子生物學預警指標, 對病人顱腦損傷程度和預后進行早期準確預測顯得尤為重要[1-2］。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1）由270個氨基酸組成, 是氧化低密度脂蛋白（oxidation low-density lipoprotein, ox-LDL）在內皮細胞的主要受體, 對ox-LDL起到特異性結合、吞噬和降解的作用, 誘導細胞增殖和凋亡, 激活細胞內信號轉導通路, 可加重外傷后繼發性腦損傷[3-4］。Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）是天然免疫受體家族, 主要表達于巨噬細胞、樹突細胞、小膠質細胞等, 在中樞神經系統的外傷性損傷、感染性損傷等發揮及其重要的作用[5-6］。本研究通過檢測顱腦損傷后血清LOX-1、TLR4表達水平, 探討二者與顱腦損傷嚴重程度及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1—12月在南京市兒童醫院就診的顱腦損傷病兒82例作為研究對象, 其中男42例, 女40例, 年齡（7.54±4.41）歲, 范圍為4～12歲；另選取同時期保健科體檢的90例健康兒童作為對照組, 其中男47例, 女43例, 年齡（8.13±3.29）歲, 范圍為4～13歲, 并做好臨床資料的登記。兩組研究對象性別（χ2=0.02,P=0.895）、年齡（t=1.00,P=0.319）比較, 差異無統計學意義（P＞0.05）, 具有可比性。預后良好組格拉斯哥昏迷量表（GCS）評分（13.05±1.66）分, 范圍為11～15分, 預后不良組GCS評分（8.64±1.89）分, 范圍為6～11分, 兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

1.2 納入及排除標準納入標準：①經頭部CT確診為顱腦外傷；②病人臨床資料完整, 配合治療；③無其他部位嚴重合并傷。排除標準：①有腦血管病、癲癇病史者；②有免疫系統疾病者；③術前使用糖皮質激素及非甾體抗炎藥；④有心、肝、腎嚴重疾病者；⑤術前、手術中發生低血壓、缺氧。入選病兒監護人或其近親屬簽署知情同意書, 本項研究所用方法符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 抽取所有受試者治療前外周靜脈血4 mL, 4 ℃ 4 000 r/min, 離心10 min, 分離血清分裝至無菌EP管, 標記后-80 ℃冰箱凍存待測。

1.3.2 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測病兒血清LOX-1、TLR4水平 采用ELISA分別檢測病兒血清LOX-1、TLR4水平, 嚴格按照試劑盒說明書進行操作, LOX-1試劑盒購自普洛邁德生物公司, TLR4試劑盒購自美國ADL公司。

1.3.3 隨訪 顱腦損傷病人出院后6個月, 觀測顱腦損傷病兒轉歸情況, 根據格拉斯哥預后量表（GOS）分級評定[7］, 分為預后不良組（病兒功能受限、活動受限, GOS為1～3級）和預后良好組（病兒恢復良好, GOS為4～5級）, 比較兩組間LOX-1、TLR4表達情況。

1.4 統計學方法統計分析采用SPSS 22.0軟件。以±s描述計量資料, 兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Pearson相關性分析檢驗顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平的關系；受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析LOX-1、TLR4水平對顱腦損傷預后不良的診斷價值；logistic回歸分析與顱腦損傷預后情況的有關因素,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4表達水平比較與對照組比較, 顱腦損傷組病兒血清LOX-1、TLR4水平升高（P＜0.05）, 見表1。

表1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4水平比較/（μg/L,±s）

表1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4水平比較/（μg/L,±s）

注：LOX-1為血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1, TLR4為Toll樣受體4。

組別對照組顱腦損傷組t值P值例數90 82 LOX-1 3.13±0.97 13.24±1.69 48.64＜0.001 TLR4 0.52±0.11 8.83±1.57 50.09＜0.001

2.2 不同轉歸病兒血清LOX-1、TLR4表達水平比較隨訪6個月期間82例顱腦損傷病兒中33例病兒預后不良（功能受限、活動受限）, 恢復良好49例。預后良好組相比, 預后不良組病兒血清LOX-1、TLR4水平升高, LOX-1和TLR4水平隨轉歸加重呈升高趨勢（P＜0.05）。見表2。

表2 不同轉歸顱腦損傷病兒血清中LOX-1和TLR4表達比較/（μg/L,±s）

表2 不同轉歸顱腦損傷病兒血清中LOX-1和TLR4表達比較/（μg/L,±s）

注：LOX-1為血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1, TLR4為Toll樣受體4。

組別預后良好組預后不良組t值P值例數49 33 LOX-1 11.17±1.28 16.31±2.30 12.97＜0.001 TLR4 7.19±1.25 11.19±2.05 10.98＜0.001

2.3 顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平的相關性顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平呈正相關（r=0.82,P＜0.001）。

2.4 血清LOX-1、TLR4水平對顱腦損傷病兒預后不良的診斷價值ROC曲線結果顯示, 血清LOX-1診斷顱腦損傷病兒預后不良的曲線下面積（AUC）為0.76, 其95%置信區間（CI）為（0.65, 0.88）, 靈敏度為66.7%, 特異度為85.7%, 截斷值為9.600 μg/L；TLR4診斷顱腦損傷病兒預后不良的AUC為0.75, 95%CI為（0.64, 0.87）, 靈敏度為63.6%, 特異度為87.8%, 截斷值為5.354 μg/L；二者聯合診斷顱腦損傷病兒預后不良的AUC為0.91, 95%CI為（0.84, 0.98）, 靈敏度為84.8%, 特異度為89.8%。與LOX-1、TLR4單獨檢測比較, 二者聯合診斷顱腦損傷AUC更高（Z=2.18、2.35,P=0.029、0.019）, 見圖1。

圖1 血清血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、Toll樣受體4（TLR4）水平診斷顱腦損傷病兒82例預后不良的ROC曲線

2.5 二元logistic回歸分析顱腦損傷病兒預后不良的影響因素將是否發生顱腦損傷不良預后作為因變量（預后良好=0, 預后不良=1）, 以顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4表達水平作為自變量, 進行二元logistic回歸分析, 結果顯示LOX-1、TLR4水平與顱腦損傷預后不良有關（P＜0.05）, 見表3。

表3 顱腦損傷病兒82例預后的影響因素分析

3 討論

有研究表明, 我國每年大約幾十萬人是死于創傷, 其中死于顱腦損傷占50%以上[8］, 顱腦損傷具有極高的致殘率和病死率, 其主要的病理變化有反應性神經膠質增生、星形膠質細胞增生形成神經膠質疤痕、神經元、膠質細胞大量變性死亡, 這些都不利于顱腦損傷恢復, 可導致病人產生長期病理生理后遺癥, 引起運動認知障礙, 嚴重影響病人生活質量[9］。顱腦損傷病情復雜多變, 預后較差, 因此顱腦損傷是神經外科的診治難題之一, 臨床上評估顱腦損傷病情、指導治療、判斷預后的常用指標有GCS、CT結果、瞳孔反應等, 但有時不能準確地反應顱腦損傷程度, 故尋找更有效的血清生化標志物非常重要[10］。

LOX-1是一種Ⅱ型跨膜蛋白, 屬于C型選擇素家族, 在血管內皮細胞表面豐富表達, 與ox-LDL特異性結合, 影響內皮功能, 損傷血管, 并促進腦外傷中的炎性反應[11-12］。徐建等[13］研究結果表明, 與健康對照組比較, 急性冠狀動脈綜合征病人血清LOX-1水平顯著升高, 可能由于血漿中ox-LDL升高誘導LOX-1水平顯著升高, ox-LDL與LOX-1特異性結合后增強巨噬細胞吞噬ox-LDL的能力, 從而破壞血管內皮細胞結構和功能。有研究結果表明, 冠心病病人血清LOX-1表達水平明顯升高, 而且LOX-1水平隨冠狀動脈病變程度的加重而升高, LOX-1表達水平上調, 促進單核細胞的黏附、聚集, 致使血管內皮損傷[14］。本研究結果表明, 與對照組比較, 顱腦損傷病兒血清LOX-1表達水平升高, 且其水平隨著顱腦損傷病情的加重而升高, 提示LOX-1在顱腦損傷的發生中發揮一定作用, LOX-1與顱腦損傷嚴重程度密切相關；預后不良病兒（死亡及植物狀態、殘廢組）血清LOX-1水平較預后良好病兒明顯增高, 提示LOX-1高表達預后不良, LOX-1高表達促進動脈粥樣硬化的發生從而影響顱腦損傷病兒恢復, 是導致顱腦損傷病兒預后不良的原因之一；ROC分析結果顯示, LOX-1診斷顱腦損傷預后的AUC為0.76, 靈敏度為66.7%, 特異度為85.7%, 截斷值為9.600 μg/L, 提示當血清LOX-1水平高于9.600 μg/L時, 顱腦損傷病兒預后不良；多因素logistic回歸分析結果表明血清LOX-1是顱腦損傷預后不良的危險因素, 提示LOX-1可作為顱腦損傷預后評估的一個新的潛在標志物。

TLR屬于I型跨膜蛋白, 約由200個氨基酸保護域組成, 參與對多種疾病的防御過程, 通過激活小膠質細胞釋放炎性因子, 與炎性反應、細胞信號傳導等過程密切相關[15-16］。TLR4作為TLRs家族中的重要成員, 在小膠質細胞, 星形膠質細胞、腦血管內皮細胞廣泛表達, 通過結合相應的配體, 使小膠質細胞等釋放炎性因子和炎性趨化因子, 在顱腦損傷繼發性損傷中發揮關鍵作用[17-18］。堯小龍等[19］研究結果表明, 顱腦損傷病人血清TLR4表達上調, 提示TLR4促進腦外傷中的炎性反應, 加重外傷后的腦水腫、繼發性損傷, TLR4在顱腦損傷發生中起非常重要的作用。有研究結果表明, 與正常對照組比較, 顱腦損傷病人血清TLR4表達水平升高, 且TLR4表達水平隨著顱腦外傷分級的增加而升高, 與顱腦外傷的嚴重程度呈正相關, 提示TLR4參與了繼發性腦損傷, TLR4是導致顱腦損傷病人病情加重影響預后不良的重要原因之一[20］。本研究結果表明, 與對照組比較, 顱腦損傷病兒血清TLR4表達水平升高, 且其水平隨著顱腦損傷病情的加重而升高, 提示TLR4在顱腦損傷的發生中發揮一定作用, 與顱腦損傷嚴重程度密切相關；預后不良病兒（死亡及植物狀態、殘廢組）血清TLR4水平較預后良好病兒明顯增高, 提示TLR4高表達可能可預測病人預后不良, 需進行監控并及時治療；經Pearson法分析顱腦損傷病人血清LOX-1、TLR4水平呈正相關, 提示LOX-1、TLR4可共同評估顱腦損傷預后情況；ROC分析結果顯示, TLR4診斷顱腦損傷預后的AUC為0.75, 靈敏度為63.6%, 特異度為87.8%, 截斷值為5.354 μg/L, LOX-1、TLR4二者聯合診斷顱腦損傷病兒預后不良的AUC為0.91, 靈敏度為84.8%, 特異度為89.8%, 與LOX-1、TLR4單獨相比, 二者聯合診斷顱腦損傷病兒預后不良的AUC更高；提示當血清TLR4水平高于5.354 μg/L時, 顱腦損傷病兒預后不良可能性較高, 二者聯合檢測可提高對顱腦損傷病兒預后不良診斷的靈敏度；多因素logistic回歸分析結果表明血清TLR4是顱腦損傷預后不良的危險因素, 提示TLR4可作為顱腦損傷預后評估的一個新的潛在標志物。

綜上所述, LOX-1、TLR4水平與顱腦損傷的病情程度以及預后有關, 可作為了解病情與轉歸的參考指標。