小麥苗期根系性狀的全基因組關聯分析與優異位點挖掘

王脈，董清峰，高珅奧，劉德政，盧山，喬朋放，陳亮，胡銀崗,2

小麥苗期根系性狀的全基因組關聯分析與優異位點挖掘

王脈1，董清峰1，高珅奧1，劉德政1，盧山1，喬朋放1，陳亮1，胡銀崗1,2

1西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2中國旱區節水農業研究院，陜西楊凌 712100

【目的】植物根系對水分及營養的獲取、作物的生長發育和產量的形成至關重要。挖掘小麥苗期根系性狀顯著關聯的SNP位點，預測相關候選基因，為解析小麥根系建成遺傳機制及選育具有優良根系構型的小麥品種奠定基礎。【方法】以189份小麥品種組成的自然群體為供試材料，調查2種培養條件（霍格蘭營養液和去離子水）下培育21 d的苗期根系總長度（TRL）、根系總表面積（TRA）、根系總體積（TRV）、根系平均直徑（ARD）及根系干重（RDW）等5個根系性狀，試驗進行2次重復，同時結合小麥660K SNP芯片的分型結果進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）。此外，通過序列比對、結構域分析和注釋信息預測候選基因，并采用競爭性等位基因（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術開發根系性狀的分子標記。【結果】霍格蘭營養液培養條件下的根系性狀變異范圍較大，根系整體粗短；而去離子水條件下的根系細長、側根較多。選用貝葉斯信息與連鎖不平衡迭代嵌套式模型（BLINK）、壓縮式混合線性模型（CMLM）、固定隨機循環概率模型（FarmCPU）以及混合線性模型（MLM）4個模型，結合2種培養條件下的根系性狀進行全基因關聯分析，共檢測到95個與小麥苗期根系性狀顯著關聯的QTL位點（＜10-3），其中，有18個QTL在2個條件下同時被檢測到，分布在7A、1B、2B、3B、7B、1D、2D及3D染色體，可解釋8.68%—14.07%的表型變異。篩選獲得的顯著性位點中，有4個與前人的研究相近或一致，其余為新發現QTL位點。對共定位的SNP進行單倍型分析，有10個SNP能夠將供試材料分為2種單倍型，且單倍型間的根系性狀具有顯著差異，同時，基于這些SNP開發KASP標記，篩選到與根系總體積及根系干重相關的2個KASP標記（和）。進一步挖掘共定位SNP位點上下游區間內的基因，篩選到12個可能與根系發育相關的候選基因，其中，編碼?；d體蛋白合成酶，參與根系脂肪酸的合成；編碼突觸融合蛋白，對植物重力向性具有重要作用；編碼醛脫氫酶，參與脫落酸的合成，從而調控作物根系發育?！窘Y論】小麥根系性狀在不同基因型間差異顯著，在2個條件下同時檢測到18個顯著QTL位點，開發了2個根系分子標記（和），并篩選出12個與根系性狀相關的候選基因。

小麥；根系性狀；全基因組關聯分析；共定位SNP位點；KASP標記；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥（L.）是世界三大主糧作物之一，全球小麥種植面積2.17億hm2，年產量約7.65億t[1]，為人類提供近20%的熱量。近年來，隨著全球人口的急劇增長，人類對小麥的需求也隨之增加。據聯合國農業組織預測：到2050年，每年至少需要生產8.4億t小麥[2]。因此，提高小麥單產對保障全球糧食生產具有重要作用。根系作為植物三大器官之一，是植物吸收礦物質養分及水分的第一部位，對植物生長起著固定和支撐作用[3]。根系建成（root system architecture，RSA）包括根系長度、根系表面積、根系體積、根系直徑、根尖數以及根系傾角等根系性狀[4]，根系構型的好壞是決定作物生長發育和提高小麥產量及抗逆性的必要因素。解析作物根系相關性狀的遺傳機制，優化作物根系構型對小麥育種具有重要意義[4-6]。【前人研究進展】近年來，國內外研究人員在根系研究方面做了大量工作，并已取得階段性成果。研究表明[7]，優良的根系構型可響應各種生物與非生物脅迫，通過信號轉導途徑影響地上部的生長，與千粒重、粒長、粒寬等產量性狀顯著正相關。Xie等[8]研究發現根長較短的小麥品種穗數、穗粒數和植株生物量均較低，而根長較長的品系生物量和籽粒產量較高。Man等[9]研究指出小麥根系干重與籽粒產量和水分利用效率呈正相關關系。此外，隨著基因組學和分子生物學研究的不斷深入，分子育種的優勢逐漸凸顯。目前，利用小麥不同遺傳群體已經定位到了許多與根系性狀相關的位點。如，Ma等[10]利用388份小麥品種在室內和室外盆栽2種環境下對根系性狀進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS），在2A、2B、3A、3B、3D、4A、5B、5D、6B染色體共檢測到36個和根系建成顯著關聯的QTL位點；陳貴菊等[11]對160份來自于河南和山東等地小麥品種的總根長、總根表面積、總根體積、平均根直徑和根尖數進行全基因組關聯分析，檢測到23個關聯位點，可解釋7.2%—12.8%的表型變異；Huang等[12]通過對周8425B×中國春構建的重組自交系群體進行根毛長度的QTL分析，檢測到4個主效QTL位點（LOD＞2.5），解釋3.32%—6.52%的表型方差。Khodaee等[13]將170份春小麥材料種植于土壤的PVC管里，對水分脅迫和正常供水條件下的根系長度及根系體積等性狀進行全基因組關聯分析，鑒定出186個顯著性SNP位點，其中一些SNP證實了先前報道的根長位點。同時，由于SNP在基因組分布廣泛且穩定性高，基于SNP檢測的競爭性等位基因（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術已普遍用于小麥抗病性和抗非生物脅迫相關基因的檢測和輔助選擇[14-16]。Qureshi等[17]借助20對KASP標記證實了小麥抗條銹病和為同一個基因。Fang等[18]開發了2對小麥抗葉銹基因的KASP標記：和，以加速小麥育種中對的輔助選擇。Rehman等[19]開發了16個與小麥抗旱相關基因座等位基因的KASP標記，分析了47份小麥材料的等位變異與籽粒產量的相關性。王志偉等[20]利用3對抗旱及抗穗發芽基因的KASP標記，對云南育成的小麥品種（系）進行基因型檢測，表明其能夠有效區分抗穗發芽和易穗發芽的品種及抗旱和非抗旱品種?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于小麥根系的難獲取性及數量性狀遺傳調控的復雜性，目前得到的小麥根系構型相關位點的數量并不多，因此，亟需擴大基因組篩選的廣度和深度，增加分子標記的數目及種類，挖掘更多主效QTL，從而對調控根系發育的基因進行精細定位。【擬解決的關鍵問題】本研究以189份小麥品種（系）組成的自然群體為材料，在霍格蘭營養液和去離子水2種培養條件下，測定苗期根系的總根長、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑及根系干重（與根系構型相關的性狀）；進一步結合高通量660K SNP芯片的基因型分析結果，對根系性狀進行全基因組關聯分析，以期發掘調控小麥根系性狀的QTL位點，開發根系分子標記，并預測與根系構型相關的候選基因，為小麥根系改良及抗逆育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以實驗室通過多年試驗，并結合35K芯片進行基因型分析的565份小麥種質中篩選出189份小麥品種（系）組成的自然群體為材料，這些品種遺傳多樣性豐富，來源廣泛，主要來自河南（73份）、陜西（51份）、山東（21份）、甘肅（16份），以及河北、江蘇、寧夏、山西、北京、安徽等地，還包括部分從澳大利亞、美國及墨西哥引進的種質（電子附表1）。

1.2 試驗設計

供試材料于2021年7—8月及2022年1—2月在西北農林科技大學旱區逆境生物學國家重點實驗室光照培養間進行水培試驗，分別采用霍格蘭營養液（hogland，HL）和去離子水（pure water，PW）進行培養，試驗均重復2次。選用大小均勻一致的小麥種子，采用75%的酒精消毒1 min，用蒸餾水沖洗，擺放在培養皿中進行發芽。幼苗長至1葉1心期時（約7 d），每個品種選擇長勢一致的4株幼苗，移栽并定植于泡沫板上，每孔種植1粒，放置于根箱中（50 cm×40 cm×30 cm），20℃恒溫培養，光照16 h/黑暗8 h，濕度為70%。每天通過氧氣泵間斷通氣10 h，培養21 d。期間每隔3 d更換1次營養液和去離子水，營養液用稀NaOH和0.1 mmol·L-1HCl調節pH至6.5。

1.3 測定指標及測定方法

植株水培21 d后，使用EPSON Perfection V700 Photo掃描儀掃描根系存成圖片，然后通過萬深LA-S根系分析儀系統（www.wseen.com）處理并分析掃描的圖片，得到根系總長度（total root length，TRL，cm）、根系總表面積（total root area，TRA，cm2）、根系總體積（total root volume，TRV，cm3）、根系平均直徑（average root diameter，ARD，mm）等參數。掃描后的根系105℃殺青30 min后，80℃烘干至恒重，用萬分之一天平測定根系干重（root drought weight，RDW，g）。

1.4 表型數據的統計分析

采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 25（https://www.ibm.com/cn-zh/spss）對根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑及根系干重等5個性狀進行統計分析，分別計算2個培養條件下各根系性狀的平均值、標準差、變異系數以及廣義遺傳力。運用R語言繪制各根系性狀的頻率分布圖，利用Origin 2021（https://www.originlab.com/origin）軟件對各根系性狀進行相關性分析。

1.5 群體結構與連鎖不平衡分析

采用改良的CTAB法提取小麥幼嫩葉片的總基因組DNA，質檢合格后，由北京博奧生物技術有限公司利用小麥660K SNP芯片對189個小麥品種進行基因分型，并采用TASSEL 5.0軟件[21]對原始數據進行質量控制和過濾，剔除缺失率和雜合度＞20%，次等位基因頻率＜5%[22]的SNP位點。基于過濾后的高質量SNP標記，采用Power Marker V3.25軟件[23]分析供試材料的遺傳多樣性和多態信息含量（polymorphic information content，），=1-Σ(P)2（P表示位點的第個等位變異出現的頻率）。進一步使用Admixture軟件[24]進行群體結構分析：令K=2—15，對交叉驗證錯誤率CV值（cross-validation error）進行5次訓練，最終將5個模型的預測值做平均，CVmin對應的K值即為最佳亞群數目。采用Origin 2021對189份小麥材料進行主成分分析（principal component analysis，PCA），并繪制亞群的3D圖。以位點間的相關系數平方（2）為參數衡量多態性位點兩兩之間的連鎖不平衡度（linkage disequilibrium，LD），使用PopLDdecay軟件[25]進行ABD基因組的連鎖不平衡分析，2的參數設置為：-MaxDist30000[25-26]。將30 000 kb LD區間劃分為10 kb的區間，以第95百分位的2值作為閾值估測LD衰減距離。

1.6 全基因組關聯分析與候選基因挖掘

通過對小麥660K SNP芯片的基因分型結果進行質控和過濾，最終獲得296 111個高質量SNP標記，用于后續的全基因組關聯分析。通過基于R語言的Gapit包（http;//www.zzlab.net/GAPIT），選用BLINK（bayesian-information and linkage-disequilibrium iteratively nested keyway）、CMLM（compressed mixed linear model）、FarmCPU（fixed and random model circulating probability unification）和MLM（mixed linear model）4個模型進行全基因組關聯分析，以=1.0×10-3為閾值，判定與目標性狀顯著關聯的SNP位點?；诠捕ㄎ坏腟NP位點，將供試品種分為2種單倍型，采用SPSS的ANOVA檢測比較2種單倍型間目標根系性狀的差異顯著性。運用Origin 2021繪制單倍型分析的箱線圖。采用R包的CMPlot繪制QQ圖和曼哈頓圖，并在共定位SNP位點LD衰減范圍內挖掘小麥根系性狀的候選基因。在NCBI數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）、InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro）、WheatOmics（http://wheatomics.sdau.edu.cn）和Ensembl plants（http://plants.ensembl.org/index.html）等網站進行候選基因的序列比對、保守結構域分析和功能注釋。利用expVIP（http://www.wheat-expression.com）獲取小麥候選基因在不同組織的表達量，并運用TBtools軟件[27]繪制基因表達量熱圖。

1.7 顯著性SNP分子標記開發及檢測

根據660K SNP芯片的遺傳圖譜信息，基于與根系性狀顯著關聯的SNP位點開發KASP標記。基于在線網站Poly Marker（http://www.polymarker.info）設計KASP引物（表1），在2條正向引物序列的5′端分別加上FAM和HEX熒光接頭序列，其中，FAM接頭序列為：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX（VIC）為：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT T-3′。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

利用根系性狀極端的小麥材料進行引物的初步篩選，篩選出具有多態性且分群明顯的KASP標記（和X），進一步在189份小麥品種組成的自然群體中進行基因型分析。KASP分型系統操作參考北京嘉程生物科技有限公司的AQP基因分型說明：384孔板反應體系包含Higeno 2×Probe Mix B 2.5 μL、引物Mix 0.07 μL（2條正向引物12 mmol·L-1，反向引物30 mmol·L-1）、DNA模板1 μL，ddH2O補至5 μL。PCR反應采用touchdown程序：95℃ 10 min；95℃ 20 s，61—55℃ 40 s，10個循環（每個循環降0.6℃）；95℃20 s，55℃ 40 s，32個循環，共計42個循環。反應完成后讀取熒光數據，通過Klustercaller SNP分型軟件檢測分型結果。

表1 多態性KASP標記的引物序列

F-P：連接FAM熒光序列的正向引物；V-P：連接HEX（VIC）熒光序列的正向引物；R-P：反向引物

F-P: Forward primer with FAM fluorescence sequence; V-P: Forward primer with HEX(VIC) fluorescence sequence; R-P: Reverse primer

2 結果

2.1 不同環境下小麥苗期根系性狀的表型分析

通過對霍格蘭營養液（HL）和去離子水（PW）2個培養條件下供試品種的根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑以及根系干重等性狀進行統計分析（電子附表2），發現2個培養條件下各根系性狀的頻率呈正態分布（圖1），表明各根系性狀是數量性狀，受多基因控制，其表型數據可用于后續的全基因組關聯分析。2種培養條件下的各根系性狀均表現出廣泛變異，變異范圍為15.43%—66.38%（表2），其中，在HL培養下的各根系性狀變異幅度較大，PW培養下的變幅相對較小。2個培養條件下的根系性狀差異明顯，HL培養下的根系總長度、根系總表面積及根系干重均顯著低于PW，而根系平均直徑及根系總體積高于PW。方差分析表明，各根系性狀在小麥品種間、培養條件間以及品種與培養條件互作下均呈極顯著差異。各根系性狀的廣義遺傳力為60.41%— 65.30%，其中，根系干重的廣義遺傳力最大（表3），表明根系性狀的遺傳穩定性較強。

表2 不同處理下小麥種質各根系性狀的描述統計分析

HL：霍格蘭營養液；PW：去離子水；TRL：根系總長度；TRA：根系總表面積；TRV：根系總體積；ARD：根系平均直徑；RDW：根系干重。下同

HL: hogland; PW: pure water; TRL: total root length; TRA: total root area; TRV: total root volume; ARD: average root diameter; RDW: root dry weight. The same as below

表3 小麥種質各根系性狀的方差分析及廣義遺傳力

***表示在＜0.001水平差異顯著 *** represents significance of difference at＜0.001

A—E：霍格蘭營養液培養；F—J：去離子水培養 A-E: Hogland culture; F-J: Pure water culture

相關分析表明（圖2），在HL和PW 2種培養條件下的根系總長度、根系總表面積、根系總體積和根系干重等根系性狀之間呈極顯著正相關。HL條件下的根系總體積、根系總長度和根系總表面積的相關系數達到0.92和0.81，而根系總長度和根系平均直徑呈負相關；PW條件下的根系總長度、根系總體積與根系總表面積的相關系數為0.96和0.90，而根系總長度與根系平均直徑呈極顯著負相關，根系干重及根系平均直徑呈顯著負相關。總之，2種培養條件下的各根系性狀間的相關性基本一致。

A：霍格蘭營養液培養；B：去離子水培養。*、**和***分別表示在P＜0.05、P＜0.01以及P＜0.001水平差異顯著。下同

2.2 SNP分布及多態性分析

利用CMplot對660K SNP標記在染色體的位置進行繪制，發現SNP標記基本覆蓋所有染色體區段，然而這些標記在各染色體的分布并不均勻，總體表現出“兩邊多中間少”的趨勢（圖3）。通過對獲得的SNP數據進行高質量質控，最終篩選出296 111個具有遺傳多樣性的SNP標記，其在A、B、D基因組的數目分別為115 694、140 634和39 783個，分別占總基因組的39.1%、47.5%和13.4%（表4）；其中，3B染色體的SNP最多（36 612個），而4D染色體的SNP最少（2 408個）。A、B基因組的遺傳多樣性分別為0.3575和0.3660，均大于D基因組。全基因組的多態信息量均值為0.2858，各亞基因組的多態信息量表現為B基因組（0.2926）＞A基因組（0.2860）＞D基因組（0.2789），說明B基因組的等位基因頻率更平等。

2.3 群體結構與連鎖不平衡分析

基于Admixture軟件對群體結構進行分析的結果表明，K=8時，CV error達到最小值，因此，可將189份小麥材料分為8個類群，將K=8生成的Q矩陣作為協變量用于后續的全基因組關聯分析（圖4-A和圖4-B）。進一步對189份小麥材料進行主成分分析，其中，前3個主成分分別可解釋表型變異的17.79%、16.09%以及14.87%（圖4-C）。該189份小麥品種（系）大多來自中國西北、華中及華東地區，其中，亞群Ⅰ有25個（13%）品種，主要包含陜西和甘肅品種；亞群Ⅱ和亞群Ⅲ分別有25個（13%）和10個（5%）品種，均主要來自河南；亞群Ⅳ有34個（18%）品種，主要包含陜西品種及少量河南品種；亞群Ⅴ有37個（20%）品種，主要為山東和河南品種，還有少量江蘇及河北品種；亞群Ⅵ有11個（6%）品種，均來自河南；亞群Ⅶ有37個（20%）品種，主要來自陜西，還有一些品種來自甘肅、河北及河南；亞群Ⅷ有10個（5%）品種，主要來自河南（電子附表1和電子附圖1）。通過PopLDdecay對小麥A、B和D亞基因組及全基因組的SNP位點進行連鎖不平衡分析表明，隨著物理距離的增加，LD明顯衰減，但整個基因組和A、B、D亞基因組的衰減存在一定差異（圖4-D）。2衰減到0.3時，整個基因組的LD平均衰減距離約為1.5 Mb，而A和B基因組的LD平均衰減距離約為1和3 Mb，D基因組的衰減距離約為0.7 Mb，與小麥進化史上D基因組的快速衰減是一致的[28]。

圖3 SNP標記在小麥各染色體的分布

A：亞群的CV error值；B：群體結構示意圖；C：189份小麥品種（系）的主成分分析；D：各亞基因組的連鎖不平衡衰減距離

表4 小麥各染色體SNP標記的數目及多態性

2.4 小麥苗期根系性狀的全基因組關聯分析

利用BLINK、CMLM、FarmCPU以及MLM模型分別對189份小麥群體的根系總長度、根系總表面積、根系總體積、根系平均直徑以及根系干重5個根系性狀進行全基因組關聯分析，在4個模型共有且閾值＜10-3的條件下，共檢測到2個培養條件與根系性狀顯著關聯的SNP位點95個（圖5和電子附表3）。

為了確保關聯的可靠性，篩選2個培養條件下同時檢測到的18個與小麥根系性狀顯著關聯且穩定遺傳的SNP位點進行后續分析（表5），其中，與根系總長度關聯的位點5個，與根系干重關聯的位點6個，與根系總表面積關聯的位點4個，與根系總體積關聯的7個，分布在7A、1B、2B、3B、7B、1D、2D和3D染色體，解釋了表型變異的8.68%—14.07%，而未檢測到在2個培養條件下均與根系直徑關聯的位點。此外，有些顯著性SNP位點同時關聯到多個根系性狀，如AX-108888527同時關聯到根系總長度及根系總表面積，AX-109029863同時關聯到根系總長度及根系干重，AX-108792070和AX-110097055關聯到根系總表面積及總體積。

A—E：霍格蘭營養液培養；F—J：去離子水培養；曼哈頓圖：從里環到外環分別為各根系性狀的BLINK、CMLM、FarmCPU以及MLM模型

A-E: Hogland culture; F-J: Pure water culture; Manhattan plots: The BLINK, CMLM, FarmCPU and MLM models of root traits from the inner to outer were respectively showed

圖5 不同培養條件下各根系性狀的環形曼哈頓圖及QQ圖

Fig.5 Circular Manhattan plots and QQ plots of root traits in different culture conditions

2.5 小麥苗期根系性狀關聯位點的單倍型分析

對2個環境中同時檢測到的顯著性SNP位點進行單倍型分析，其中，5個SNP位點（AX-108924279、AX-110371944、AX-110455550、AX-110567747和AX-109933707）共定位于2B染色體57.144—57.960 Mb的連鎖群，與根系干重顯著相關（圖6-A），其分別處于的外顯子和內含子、的下游以及的內含子區域。利用其將189份小麥品種分為2個單倍型（Hap1和Hap2；圖6-B），其中Hap1出現的頻率為56.8%，Hap2的頻率為43.2%。在HL和PW培養條件下，2個單倍型之間的根系干重存在顯著和極顯著差異（圖6-C），Hap2顯著提高了小麥苗期的根系干重，是優異單倍型。

此外，除連鎖群內的SNP外，進一步對7個單個SNP將供試品種分為2種單倍型進行分析（圖7）。其中，2D染色體的AX-108888527位于下游397 bp，與根系總長度及根系總表面積顯著關聯。在HL培養條件下，2種單倍型的根系總長度及根系總表面積均存在極顯著差異；PW培養條件下，2種單倍型的根系總長度存在顯著差異，而根系總表面積間差異不顯著（圖7-A—B）。1B染色體的AX-109555941位于的3端非翻譯區，與根系總長度顯著關聯，2種單倍型間的根系總長度在HL和PW培養條件下存在極顯著和顯著差異（圖7-C）。1B染色體的AX-110491393位于上游616 bp，與根系總體積顯著關聯，在HL和PW培養條件下，Hap2的根系總體積極顯著和顯著高于Hap1（圖7-D）。1D染色體的AX-94823257位于的外顯子區域，與根系總體積顯著關聯，在HL和PW培養條件下，Hap2的根系總體積分別極顯著和顯著高于Hap1的根系總體積（圖7-E）。2B染色體的AX-111514405位于和之間，與根系總長度顯著關聯，2種培養條件下Hap1的根系總長度均顯著高于Hap2（圖7-F）。2B染色體的AX-108889829及7B染色體的AX-110122975分別與根系總長度和根系總體積顯著關聯。在PW培養條件下，2種單倍型間的根系總長度和根系總體積差異極顯著，而在HL培養條件下差異不顯著（圖7-G—H）。

表5 2種培養條件下同時檢測到的顯著性SNP位點

2.6 候選基因預測及表達量分析

依據LD衰減距離，通過中國春基因組數據庫，對上述18個顯著SNP連鎖區間內的序列進行檢索和比對，共篩選出12個主效候選基因，利用Ensemble Plants及WheatOmics等網站對候選基因進行功能注釋，發現其主要編碼MLO蛋白、轉運蛋白、解毒蛋白、?；d體蛋白合成酶和醛脫氫酶等（表6）。

基于expVIP網站獲取這12個候選基因在不同組織中的表達信息，這些候選基因均在根系中高表達，根據表達模式可將其分為4類（圖8）。第1類包含3個基因（、和），在根系中表達量最高，在莖葉、穗部和籽粒當中表達量均較少；第2類包含4個基因（、、和），在各組織中的表達量為根系＞穗部＞莖葉＞籽粒；第3類包含2個基因，和，在根系和籽粒中表達量較高，莖葉和穗部較少；第4類包含3個基因（、和），在根系當中表達量最高，穗部和籽粒次之，莖葉中幾乎不表達。

A：2B染色體57.144—57.960 Mb連鎖熱圖；B：不同等位基因的2種單倍型；C：不同單倍型的表型效應

表6 根系相關性狀候選基因及其功能注釋

圖7 小麥苗期根系性狀顯著性SNP位點的單倍型分析

紅色代表該基因在某組織中表達量高；粉色或白色則代表在某組織表達量低

2.7 KASP標記開發及小麥自然群體的檢測

為了對小麥根系進行分子標記輔助選擇，依據2個培養條件下共定位到的顯著性SNP設計KASP引物，在根系極端材料中進行初步篩選，最終依據AX-110497143和AX-109933707開發了2個KASP標記（和），對189份小麥品種組成的自然群體進行檢測，2個標記能夠對其中171份小麥品種進行明顯分型，而剩余18份材料分型不明顯（圖9）。標記鑒定出基因型為CC的小麥品種165份，基因型為TT的6份，兩者間的根系總體積差異極顯著（=2×10-6）；標記鑒定出CC基因型的94份，TT基因型的77份，兩者間的根系干重差異顯著（=0.001，表7）。

3 討論

3.1 不同培養條件下小麥苗期根系性狀的表型差異

苗期是小麥形態器官建成的關鍵階段[29]，苗期的生長發育直接關系到后期生長的好壞。而根系作為植物三大器官之一，是植物吸收礦物質養分、水分傳導的第一部位，是植物生長發育的源泉，對植物生長起著固定和支持作用。有研究表明[30]小麥成穗數與小麥根系發達程度，特別是和種子根數和根系表面積及體積呈明顯的正相關，從而促進小麥產量的提高。在本研究中，2種培養條件下的根系構型具有明顯差異：HL培養條件下的根系整體較粗且短；PW培養條件下的主根細而長，側根也較多。相關性分析表明，各根系性狀間具有顯著的相關性，說明根系總長度、根系總表面積和總體積等根系性狀間可能存在協同互作，有效地提高水分吸收效率[31]。此外，根系長度和根系直徑負相關，這可能是造成PW培養條件下根系較長但直徑較小的原因。由此推測在PW培養條件下，植株胚乳中的養分足以供給苗期小麥的生長發育，過多的營養可能會抑制幼苗根系的生長。營養元素對小麥植株的生長不可或缺，但施用過多非但無益，反而造成更嚴重的后果。有研究表明[32]，氮素過剩會導致植株生育延遲，易感病蟲害；鎂元素過剩會阻礙植株生長等。因此，在短期的苗期水培試驗中可直接采用去離子水培養，可能取得更佳的效果。

3.2 小麥苗期根系性狀顯著關聯位點分析

本研究對5個小麥苗期的根系性狀進行全基因組關聯分析，2個培養條件下共檢測到95個顯著性關聯位點，2個條件下均檢測到的有18個。其中，4個SNP位點與前人通過不同小麥群體進行全基因組關聯分析定位的位點相近或一致。如本研究檢測到的4A和5B染色體上與根系干重顯著關聯的標記AX-109480568和AX-111009146和王博華等[33]利用國內外300份小麥群體定位的根系干重顯著關聯標記及分別相距6.5和6.0 Mb；1D染色體與根系總長度顯著關聯的標記AX-111062954和Xu等[34]利用中國黃淮麥區196份小麥材料在2個環境下共定位的根系總長度關聯標記相距0.1 Mb；3B染色體與根系總面積顯著關聯的標記AX-109948487和Liu等[35]利用黃淮麥區165份小麥群體定位的根系總表面積相關標記相同。其余顯著關聯位點為新發現的，進一步對其進行深入分析可能對解析根系建成遺傳機制具有重要意義。

表7 XNR7143和XNR3707在小麥自然群體中的表型驗證

**表示在＜0.01水平差異顯著 ** represent significance of difference at＜0.01

紅色代表標記的堿基紅色代表標記的堿基為TT的純合個體；藍色代表標記的堿基為CC的純合個體；黑色代表無DNA對照；粉色是無法分型的個體

3.3 小麥根系候選基因功能預測

本研究通過小麥根系性狀顯著關聯的SNP標記序列對小麥中國春基因組序列進行比對分析，依據基因功能注釋發現了12個可能調控小麥根系發育的候選基因。其中位于7A染色體的（）編碼3-氧酰基-?；d體蛋白合成酶，研究表明該酶參與植物脂肪酸從頭合成的縮合反應，在脂肪酸合成過程中扮演重要角色[36]。水稻同源基因過表達，其主根長和側根明顯縮短，根部伸長區和成熟區的細胞長度變短，根中棕櫚酸和亞麻酸含量明顯增加[37]，推測可能是通過參與根系脂肪酸的合成影響小麥根系發育。位于1B染色體的（）編碼突觸融合蛋白，具有SNARE結構域，該蛋白除參與膜泡運輸外，還與植物抗病性及植物的向重力性有關[38]，推測可能通過參與根冠造粉體的形成，從而保證根系的向地生長。位于2B染色體的（）和（）編碼MLO蛋白，研究表明，植物MLO蛋白除與白粉病菌互作外，還受到干旱脅迫和脫落酸誘導，擬南芥突變會導致其不正常的根部形態，發生嚴重的卷曲[39]。位于2B染色體的（）編碼WUSCHEL蛋白，WUSCHEL相關同源盒是植物特異轉錄因子家族，具有調節植物干細胞分裂分化動態平衡和植物器官發育等重要功能[40]。其水稻同源基因是不定根生長發育的關鍵調節因子，過量表達使不定根提早產生，數目增加；此外該基因的表達還受外源生長素和細胞分裂素的誘導[41]。位于2B染色體的（）編碼三磷酸腺苷雙磷酸酶，該酶調節胞內外ATP穩態，在植物的各種應激適應及脅迫中發揮重要作用[42]。其水稻同源基因的一個單堿基替換導致異常的cDNA剪接，從而影響水稻根毛細胞的膨大，對水稻根毛伸長及植株生長發育十分重要[43]。位于7B染色體的TraesCS7B02G417900（）編碼醛脫氫酶，而植物醛脫氫酶是植物激素脫落酸生物合成的最后一步，因此可能通過合成ABA進而調控主根、側根及根毛的生長發育[44]。位于3D染色體的（）編碼分子伴侶dnaJ，參與新生肽的折疊、裝配和運輸過程。研究表明dnaJ-like蛋白在植物形態建成及非生物脅迫方面具有重要作用[45]，推測可能通過調節根系發育來響應干旱脅迫、參與重金屬解毒。對這些候選基因的進一步功能解析，將有助于構建小麥根系調控的基因網絡。

3.4 小麥根系分子標記的開發與檢測

KASP技術作為一種基于熒光檢測的基因分型技術，具有高通量、低成本、準確性高及減少傳統育種工作量等優點，目前，已經廣泛應用于植物、動物和人類的遺傳學研究與群體分型[46-49]。本研究通過對2種培養條件下共定位的顯著性SNP進行KASP標記開發，最終篩選出能夠明顯分型的和2個KASP標記，其中將171份小麥群體分為根系總體積不同的2個基因型，頻率分別為96.5%和3.5%；而將供試材料分為與根系干重相關的2個基因型，頻率為55.0%和45.0%。此外，試驗表明分型的2個亞群之間的數目具有明顯差異，CC基因型為主要亞群，這可能是由于人工選擇等因素導致。以上2個分子標記可用作小麥優異種質資源的快速鑒定，為輔助選擇優良根系建成的基因型提供了分子標記。

4 結論

不同水培條件下，小麥苗期根系性狀存在不同程度的差異：霍格蘭營養液培養條件下的根系直徑較粗且根長較短；而去離子水培養條件下的主根細長，側根居多。通過利用660K SNP芯片對小麥苗期的5個根系性狀進行全基因組關聯分析發現：4個模型同時檢測到95個顯著關聯的SNP位點，其中，在2種培養條件下均檢測到的SNP位點有18個，同時基于上述共定位的多態性SNP開發了與根系總體積及根系干重相關的2個KASP標記（和），挖掘到12個可能與根系發育相關的候選基因。

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Genome-Wide Association Studies and Mining for Favorable Loci of Root Traits at Seedling Stage in Wheat

WANG Mai1, DONG QingFeng1, GAO ShenAo1, LIU DeZheng1, LU Shan1, QIAO PengFang1, CHEN Liang1, HU YinGang1,2

1College of Agronomy, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Water-Saving Agriculture in Arid Areas of China, Yangling 712100, Shaanxi

【Objective】Plant roots are critical for water and nutrient acquisition, crop growth and development as well as yield formation. Exploring SNP loci significantly associated with root traits in wheat at seedling stage and mining candidate genes, will lay a foundation for understanding the genetic mechanism of wheat root system architecture and breeding wheat elite varieties with better root architecture.【Method】In this study, 189 diverse wheat cultivars were assembled as an association-mapping panel, five root traits including total root length (TRL), total root area (TRA), total root volume (TRV), average root diameter (ARD) and root dry weight (RDW) were investigated by growing in two culture conditions (Hoagland nutrient solution and pure water), and the experiments were repeated twice. Then, genome-wide association studies (GWAS) were performed for the five root traits with genotypic data derived from Wheat 660K SNP Array. Candidate genes were predicted by sequence alignment, domain analysis, and annotation information. Futhermore, kompetitive allele specific PCR (KASP) markers were developed for root traits. 【Result】The root traits varied greatly among the 189 cultivars, and the roots were thick and short cultured under Hoagland nutrient solution, while slender seminal roots and more lateral roots were observed under pure water. A total of 95 QTLs significantly associated with root traits cultured in two conditions (＜10-3) were identified by genome-wide association studies with four models of BLINK (bayesian-information and linkage-disequilibrium iteratively nested keyway), CMLM (compressed mixed linear model), FarmCPU (fixed and random model circulating probability unification) and MLM (mixed linear model). Among them, 18 QTLs were detected in both culture conditions and distributed on chromosomes of 7A, 1B, 2B, 3B, 7B, 1D, 2D, and 3D, which explained 8.68%-14.07% of phenotypic variation. Of those significant loci, 4 QTLs were similar or consistent with thatreported previously, and the rest were novel ones. Haplotype analysis conducted for co-localization QTLs of 10 SNPs revealed significant differences in root traits between the two haplotypes of wheat cultivars. Based on these SNPs, KASP markersandwere developed for total root volume and root dry weight, respectively. In addition, 12 candidate genes possibly regulating root development were found by mining the genes within the interval of co-localization significant SNPs. Of them,, encoding 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase, is involved in the synthesis of root fatty acids;,encoding syntaxin, plays an important role in plant tropism;, encoding aldehyde oxidase, contributes to the synthesis of abscisic acid and regulation of crop root development. 【Conclusion】The root traits of wheat varied significantly among the wheat genotypes. Genome-wide association studies detected 18 significant QTLs linked with root traits simultaneously in two culture conditions, two KASP markers were developed for root traits, and 12 candidate genes related to root development were screened, which might provide reference for understanding the regulation mechanism of wheat root traits and molecular marker-assisted breeding for wheat improvement.

wheat; root traits; genome-wide association study; co-localization SNPs; KASP (kompetitive allele specific PCR) markers; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.001

2022-10-06；

2022-12-13

陜西省重點研發計劃（2021KWZ-23）

王脈，E-mail：599157540@qq.com。通信作者胡銀崗，E-mail：huyingang@nwafu.edu.cn

（責任編輯 李莉）