野野村放線菌DB-3-04產(chǎn)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

李文科 張仁文 萬(wàn)傳星

摘要：目的 優(yōu)化野野村放線菌產(chǎn)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及Box-benhnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化A-40926 B0發(fā)酵培養(yǎng)基，使用Design Expert 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果 培養(yǎng)基各成分中影響A-40926 B0產(chǎn)量的4個(gè)主要因素是麥芽糊精、黃豆餅粉、酵母浸粉和魚(yú)蛋白胨，其最佳濃度分別為38.18、46.00、21.29和6.06 g/L，A-40926 B0產(chǎn)量達(dá)到2379.67 mg/L。結(jié)論 經(jīng)優(yōu)化后，A-40926 B0的搖瓶產(chǎn)量較原始培養(yǎng)基產(chǎn)量提高了281.39%，為后期發(fā)酵罐中試與生產(chǎn)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：達(dá)巴萬(wàn)星，野野村放線菌DB-3-04，響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization of fermentation medium for the production of dalbavancin precursor A-40926 B0 by Nonomuraea sp. DB-3-04

Li Wenke1，2 Zhang Renwen2， and Wan Chuanxing1

（1 State Key Laboratory Breeding Base for the Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin Co-funded by Xinjiang Production & Construction Corps and The Ministry of Science & Technology/College of Life Science and Technology， Tarim University， Alar 843300; 2 Hubei HONCH Pharmaceutical Co.， Ltd.， Huanggang 438000）

Abstract Objective The objective of this study was to optimize the fermentation medium formulation of the dalbavancin precursor A-40926 B0 from Nonomuraea sp. DB-3-04. Methods The fermentation medium for producing A-40926 B0 was optimized by Plackett-Burman test， steepest climb test and Box-benhnken response surface method on the basis of single factor test， and the experimental data were analyzed by Design Expert 13.0. Results The four main factors affecting the yield of A-40926 B0 in the various components of the medium were maltodextrin， soybean cake powder， yeast impregnated powder and fish peptone. The optimal concentrations were 38.18， 46.00， 21.29 and 6.06 g/L， respectively， and the yield of A-40926 B0 reached up to 2379.67 mg/L. Conclusion The yield of A-40926 B0 after optimization was increased by 281.39% compared with the yield of the original medium， which provided an important reference for the pilot and production of later fermentation tanks.

Key words Dalbavancin; Nonomuraea sp. DB-3-04; Response surface method

達(dá)巴萬(wàn)星（dalbavancin）是1種新型半合成糖肽抗生素[1]，由A0、A1、B0、B1和B2等5種化學(xué)物質(zhì)組成，其中主要成分為B0，占比為90%[1-2]。達(dá)巴萬(wàn)星由Durata公司研發(fā)，于2014年5月獲得FDA的批準(zhǔn)，用于治療成人急性細(xì)菌性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染（ABSSSI）[3]。前體A40926最初是從野野村放線菌Nonomuraea sp. ATCC39727發(fā)酵產(chǎn)生的1種天然糖肽類(lèi)抗生素[4]。結(jié)構(gòu)和活性與替考拉寧相似[5]，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和鏈球菌表現(xiàn)出有效的活性，對(duì)維持其他抗菌藥物的有效性和減少耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生也有顯著效果[6-8]。

微生物產(chǎn)生次生代謝物高度依賴(lài)于存在的菌株及其培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基組成的微小變化可以顯著影響次級(jí)代謝物的產(chǎn)量和微生物的生長(zhǎng)代謝。培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化對(duì)于提高抗生素產(chǎn)量至關(guān)重要[9]。響應(yīng)面方法（response surface methodology，RSM）是通過(guò)應(yīng)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的重要方法和有效工具[10-11]。使用響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件主要基于以下實(shí)驗(yàn)[12]：使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)來(lái)確定顯著影響發(fā)酵過(guò)程的因素；通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)確定顯著因素的大致范圍；運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以建立發(fā)酵模型并確定最佳發(fā)酵條件。響應(yīng)面法已被廣泛用于優(yōu)化微生物發(fā)酵過(guò)程，它可以快速確定多種因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物收率的影響。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為后續(xù)的發(fā)酵罐中試和生產(chǎn)提供重要參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試菌株為Nonomuraea sp. DB-3-04 （本實(shí)驗(yàn)室保藏）。

1.1.2 培養(yǎng)基種類(lèi)和成分

固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，可溶性淀粉20，酵母提取物5，胰酪蛋白胨5，碳酸鈣1，瓊脂18，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉15，蛋白胨8，葡萄糖15，酵母浸粉10，硝酸鉀1，七水硫酸鎂1，碳酸鈣3，pH 7.0～7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15，黃豆餅粉20，麥芽糊精20，酵母浸粉15，七水硫酸鎂2，碳酸鈣3，pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和試劑

生化培養(yǎng)箱（BJPX-350-1型，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司），恒溫恒濕搖床（HZQ-QB型，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司），高效液相色譜儀（UltiMate3000型，美國(guó)Thermo公司），色譜柱（ODS-2HypersilTM C18，250 mm×4.6mm，5 μm），A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)品（上海麥克林生化科技股份有限公司），葡萄糖、麥芽糊精（秦皇島驪驊淀粉股份有限公司），酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、魚(yú)蛋白胨（安琪酵母股份有限公司），黃豆餅粉（青島科瑞培養(yǎng)基有限公司），L-纈氨酸（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

1.2 培養(yǎng)條件

將保藏的菌種由甘油管接種到斜面或平板培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)7～14 d，然后將新鮮的斜面用竹簽刮取1 cm2大小菌體轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)液中，裝液量30 mL（250 mL三角瓶）于28 ℃、260 r/min的搖床上培養(yǎng)72 h左右，以10%（V/V）接種量，將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL三角瓶中于28 ℃、270 r/min的搖床上培養(yǎng)9 d后終止搖瓶發(fā)酵，取樣進(jìn)行檢測(cè)分析，方法見(jiàn)“1.4”。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)品溶解于50%乙腈中，制成濃度為500 mg/L的A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)品母液，將其稀釋至25、50、100、125、175、200和250 mg/L。用于繪制A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，固定氮源不變篩選碳源，進(jìn)一步考察碳源復(fù)配和最佳濃度配比，繼續(xù)篩選氮源和考察氮源復(fù)配和最佳濃度配比，然后進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽和氨基酸種類(lèi)篩選，進(jìn)一步考察最佳濃度，最后考察煙酸對(duì)A-40926 B0發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)A-40926 B0的發(fā)酵特點(diǎn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果，以影響A-40926 B0發(fā)酵的9個(gè)因素（葡萄糖、麥芽糊精、黃豆餅粉、酵母浸粉、魚(yú)蛋白胨、七水硫酸鎂、硫酸亞鐵、L-纈氨酸、煙酸）作為PB設(shè)計(jì)的9個(gè)因子（A、B、C、D、E、F、G、H、J），每個(gè)因素選取2個(gè)水平，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上取低水平（-1）和高水平（+1）。實(shí)驗(yàn)選用n=11的PB設(shè)計(jì)，設(shè)置2個(gè)虛擬項(xiàng)做誤差分析，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)顯著影響因子合適的步長(zhǎng)和爬坡方向，其他因子的濃度為初始添加濃度，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，以此找到響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心點(diǎn)，通過(guò)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)針對(duì)顯著影響因子設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值。

1.4 分析方法

發(fā)酵液中A-40926 B0測(cè)定方法：取培養(yǎng)好的發(fā)酵液用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 12，取發(fā)酵液5 mL，用相同體積甲醇浸提，超聲30 min，8000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)膜過(guò)濾進(jìn)行HPLC分析。液相條件為流動(dòng)相A：乙腈：水=1：9（1000 mL流動(dòng)相A含1.54 g醋酸銨）；流動(dòng)相B：乙腈，流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。梯度洗脫0～11 min，B濃度變化18%～32%；11～15 min，B濃度變化32%～18%。運(yùn)行時(shí)間21 min[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 13.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和BBD響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將配制好的A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析，以A-40926 B0濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)繪制A-40926 B0標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0濃度X與峰面積Y之間具有良好的線性關(guān)系，Y=0.0458X-0.0058，相關(guān)系數(shù) R2=0.9993。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量的影響

碳源通常通過(guò)直接影響微生物的生長(zhǎng)、糖代謝及相關(guān)代謝影響抗生素的合成與分泌[14]。以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，固定氮源不變，選取初始濃度為20 g/L的葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糊精、甘油、可溶性淀粉和玉米淀粉作為唯一的碳源。碳源優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，當(dāng)葡萄糖作為唯一碳源時(shí)A-40926 B0產(chǎn)量最高為483.65 mg/L，而采用葡萄糖15 g/L與麥芽糊精20 g/L組合的初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量為845.67 mg/L，說(shuō)明葡萄糖與其他遲效碳源組合有利于A-40926 B0的產(chǎn)生。考察葡萄糖的添加量的影響為（5～50 g/L）結(jié)果表明，葡萄糖最適濃度為20 g/L，產(chǎn)量為932.34 mg/L，進(jìn)一步考察葡萄糖與其他遲效碳源組合的影響，選擇葡萄糖20 g/L與麥芽糊精、甘油、玉米淀粉進(jìn)行組合選取濃度為15、20、25、30和35 g/L，其他成分保持不變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。葡萄糖與麥芽糊精組合效果最好，麥芽糊精30 g/L時(shí)產(chǎn)量最高為1154.56 mg/L。

2.2.2 氮源對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，固定碳源不變，選取初始濃度為20 g/L的酵母膏、酵母浸粉、玉米漿干粉、棉籽蛋白粉、黃豆餅粉、蛋白胨、酪蛋白胨、花生餅粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鉀作為唯一的氮源。氮源優(yōu)化結(jié)果如圖4，黃豆餅粉作為單一氮源時(shí)產(chǎn)量最高，但還是低于初始發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆餅粉20 g/L和酵母浸粉15 g/L的組合，說(shuō)明黃豆餅粉與其他氮源組合效果更好。考察黃豆餅粉濃度影響，選取的黃豆餅粉添加量為10～60 g/L，結(jié)果表明，黃豆餅粉濃度為40 g/L，產(chǎn)量最高為1235.34 mg/L。進(jìn)一步考察黃豆餅粉與其他氮源組合，選擇黃豆餅粉40 g/L與酵母浸粉、魚(yú)蛋白胨、蛋白胨進(jìn)行組合選取濃度為5、10、15、20和25 g/L，其他成分保持不變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。黃豆餅粉與酵母浸粉組合效果最好，酵母浸粉15 g/L時(shí)產(chǎn)量最高為1452.58 mg/L，但在黃豆餅粉和酵母浸粉組合基礎(chǔ)上加魚(yú)蛋白胨10 g/L，組合后產(chǎn)量高達(dá)1603.22 mg/L。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量的影響

在優(yōu)化碳氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上考察無(wú)機(jī)鹽對(duì)A-40926 B0產(chǎn)量的影響，以不加無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，取1 g/L的磷酸氫二甲、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鈉、七水硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銅、鉬酸鈉、氯化錳、硫酸鋅作為唯一的無(wú)機(jī)鹽，結(jié)果如圖6。與對(duì)照相比添加硫酸亞鐵和七水硫酸鎂都能促進(jìn)A-40926 B0的合成，產(chǎn)量分別為1648.55 mg/L、1635.50 mg/L。分別對(duì)硫酸亞鐵和七水硫酸鎂做了0.5、1、1.5、2、2.5和3g/L最適濃度考察，結(jié)果表明，硫酸亞鐵1 g/L和七水硫酸鎂2 g/L時(shí)A-40926 B0產(chǎn)量最高，分別為1643.56和1673.35 mg/L（圖7）。

2.2.4 氨基酸對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量的影響

在優(yōu)化無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上考察氨基酸對(duì)A-40926 B0產(chǎn)量的影響，以不加氨基酸的培養(yǎng)基為對(duì)照，選取初始濃度為2 g/L的L-精氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-色氨酸、酪氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽作為唯一的氨基酸，結(jié)果如圖8。L-纈氨酸對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0合成具有明顯促進(jìn)作用，產(chǎn)量高達(dá)1947.00 mg/L。這與Beltrametti等[15]報(bào)道的結(jié)果一致，L-纈氨酸是A-40926 B0潛在前體，對(duì)L-纈氨酸做了1、3、5、7和9g/L最適濃度考察，結(jié)果表明，L-纈氨酸在3 g/L時(shí)A-40926 B0產(chǎn)量最高為2011.87 mg/L（圖9）。

2.2.5 煙酸對(duì)達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量的影響

除氨基酸外其他生長(zhǎng)因子是否對(duì)A-40926 B0產(chǎn)量產(chǎn)生影響，煙酸在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較廣，且煙酸用于代謝中合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。NAD對(duì)于糖酵解和檸檬酸循環(huán)以及ATP的再生至關(guān)重要[16-17]。選用煙酸這一生長(zhǎng)因子考察對(duì)A-40926 B0產(chǎn)量的影響，通過(guò)向培養(yǎng)基中加入0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 g/L的煙酸，結(jié)果表明煙酸能明顯提高A-40926 B0產(chǎn)量，添加量為0.75 g/L時(shí)，產(chǎn)量達(dá)2115.4 mg/L相較于未添加煙酸產(chǎn)量提高了5.1%。

通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化后的初始培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g/L、麥芽糊精30 g/L、黃豆餅粉40 g/L、酵母浸粉15 g/L、魚(yú)蛋白胨10 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、硫酸亞鐵1 g/L、L-纈氨酸3 g/L、煙酸0.75 g/L、碳酸鈣3 g/L。在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行以下優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，以A-40926 B0產(chǎn)量（Titer，mg/L）作為響應(yīng)值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到關(guān)于A-40926 B0產(chǎn)量的多元一次回歸方程：A-40926 B0產(chǎn)量=2055.98-19.12×A+49.30×B+22.61×C+74.90×D-20.51×E+11.60×F-13.62×G+20.44×H+16.46×J。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析表明：因素A、B、C、D、E、H均顯著（P<0.05），由F檢驗(yàn)表明B、C、D、E是構(gòu)建模型的主要影響因子。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果中麥芽糊精B、黃豆餅粉C和酵母浸粉D為正效應(yīng)因子（t值為正），魚(yú)蛋白胨E為負(fù)效應(yīng)因子（t值為負(fù)）。如表4所示，在試驗(yàn)2條件下，A-40926 B0產(chǎn)量達(dá)到最大，這說(shuō)明在第二組試驗(yàn)條件附近存在最優(yōu)發(fā)酵條件，故以試驗(yàn)2的條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到中心點(diǎn)：麥芽糊精37.5 g/L、黃豆餅粉47.5 g/L、酵母浸粉20 g/L、魚(yú)蛋白胨6 g/L，應(yīng)用Design Expert 13軟件，采用Box-Behnken方法對(duì)菌株DB-3-04產(chǎn)A-40926 B0發(fā)酵進(jìn)行4因子3水平（表5～6）的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。經(jīng)Design-Expert13軟件擬合，各因素對(duì)A-40926 B0產(chǎn)量的編碼值回歸方程如下：A-40926 B0產(chǎn)量=2361.61+8.25×A-51.74×B+25.55×C+7.62×D-13.26×AB+10.89×AC-14.26×AD-19.28×BC-4.89×BD-0.49×CD-36.67×A2-53.38×B2-46.44×C2-50.52×D2。回歸方程的校正系數(shù)R2為0.9570，說(shuō)明方程的擬合度良好，可有效預(yù)測(cè)A40926 B0產(chǎn)量的最優(yōu)組合。

方差分析結(jié)果由表7可知，模型f值為45.50，P<0.0001，失擬項(xiàng)的P值為0.3636，該值不顯著，信噪比為19.3494大于4，說(shuō)明模型顯著性極好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用Design Expert 13.0軟件求出當(dāng)A（麥芽糊精）38.18 g/L、B（黃豆餅粉）46.00 g/L、C（酵母浸粉）21.29 g/L、D（魚(yú)蛋白胨）6.06 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)A-40926 B0產(chǎn)量的最大值可以達(dá)到2383.98 mg/L。

根據(jù)Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出三維響應(yīng)面圖，如圖10所示。

2.6 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g/L麥芽糊精38.18 g/L、黃豆餅粉46.00 g/L、酵母浸粉21.29 g/L、魚(yú)蛋白胨6.06 g/L、硫酸亞鐵1 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、L-纈氨酸3 g/L、煙酸0.75 g/L、碳酸鈣3 g/L，pH 7.0。優(yōu)化后A-40926 B0產(chǎn)量為2379.67 mg/L，比響應(yīng)面優(yōu)化之前的產(chǎn)量845.67 mg/L提高了281.39%，且與預(yù)測(cè)值2383.98 mg/L十分接近，證明此響應(yīng)面模擬參數(shù)較為可靠，具有使用價(jià)值。

3 討論與結(jié)論

達(dá)巴萬(wàn)星結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前不能通過(guò)化學(xué)合成方法制取，只能通過(guò)發(fā)酵半合成的方式獲得，通過(guò)發(fā)酵得到的前體A-40926 B0的基礎(chǔ)上，經(jīng)氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解、成鹽得到達(dá)巴萬(wàn)星[18]。因此通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化提高達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0產(chǎn)量尤為重要。

近年來(lái)，主要以菌種誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化來(lái)提高達(dá)巴萬(wàn)星發(fā)酵水平，陳昌發(fā)等[19]利用紫外和亞硝基胍誘變技術(shù)，通過(guò)搖瓶和發(fā)酵罐工藝優(yōu)化，A-40926 B0產(chǎn)量達(dá)到1223 mg/L。王小連等[20]通過(guò)UV-ARTP復(fù)合誘變，使產(chǎn)量提高了68.7%。梁育松等[21]采用ARTP誘變選育，通過(guò)搖瓶工藝優(yōu)化和發(fā)酵罐驗(yàn)證，A-40926 B0產(chǎn)量達(dá)到2863.8 mg/L。響應(yīng)面法是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，通過(guò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型來(lái)優(yōu)化多個(gè)因素之間的關(guān)系，可用于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、數(shù)據(jù)可視化分析、精度高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基成分的優(yōu)化[22-25]。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化達(dá)巴萬(wàn)星前體A-40926 B0發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g/L麥芽糊精38.18 g/L、黃豆餅粉46.00 g/L、酵母浸粉21.29 g/L、魚(yú)蛋白胨6.06 g/L、硫酸亞鐵1 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、L-纈氨酸3 g/L、煙酸0.75 g/L、碳酸鈣3 g/L，優(yōu)化后的培養(yǎng)基其A-40926 B0產(chǎn)量較原始培養(yǎng)基提高了281.39%，為后期發(fā)酵罐中試和大規(guī)模生產(chǎn)提供重要參考。

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