熒光定量PCR方法檢測頭孢類產品中的殘留DNA

蔣惠源 張培培 仇雅靜 王琰

摘要：目的 熒光實時定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測頭孢類產品中殘留DNA方法開發、驗證及應用。方法 采用柱式游離DNA抽提試劑盒（離心柱法）提取供試品中殘留DNA；將已知濃度的產黃枝頂孢霉基因組DNA標準溶液系列稀釋后，根據DNA標準溶液的循環閾值與濃度之間的線性關系，對5種頭孢類產品中的殘留DNA進行定量分析；對方法進行專屬性、線性和范圍、準確度、精密度驗證，并使用該方法對5種頭孢類產品進行殘留DNA檢測。結果 DNA標準溶液的線性范圍為10 fg/μL～1 ng/μL、相關系數R2＞0.99、擴增效率為90%～110%、LOD相當于83 pg/g，質控樣品回收率為 50%～150%，供試品相對標準偏差（RSD）均小于30%，方法學驗證的各項參數均符合規定。結論 離心柱法結合qPCR探針法能夠簡便、快速、準確地對5種頭孢類抗生素中的殘留DNA進行定量測定，方法的專屬性、線性、準確度、精密度等各項指標均可達到方法驗證的要求，適用于頭孢類產品中殘留DNA的檢測，對其他發酵或半合成抗生素的質量控制具有借鑒意義。

關鍵詞：熒光定量PCR；頭孢類產品；發酵和半合成類抗生素；殘留DNA

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Detection of residual DNA in cephalosporin products by real-time fluorescence quantitative PCR

Jiang Huiyuan1， Zhang Peipei2， Qiu Yajing1， and? Wang Yan2

（1 Taizhou Institute for Drug Control， Taizhou 225300; 2 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629）

Abstract Objective To develop， verify and apply the detection of residual DNA in cephalosporin products by real-time fluorescence quantitative PCR （RTFQ-PCR）. Methods The residual DNA was extracted by the Ezup column-free DNA extraction kit （centrifugal column method）. After diluting the known concentration of the Acremonium chrysogenum genomic DNA standard solution series， the residual DNA in 5 cephalosporin products was quantitatively analyzed according to the linear relationship between the circulation threshold of the DNA standard solution and the concentration. The specificity， linearity， range， accuracy and precision of the method were verified， and the method was used to detect residual DNA in 5 cephalosporin products. Results The linear range of the DNA standard solution was 10 fg/μL～1 ng/μL， the correlation coefficient R2>0.99， the amplification efficiency was 90%～110%， and the LOD equivalent was 83 pg/g. The recovery rate of quality control samples was 50%～150%， and the relative standard deviation （RSD） was less than 30%. The parameters of methodological verification met the requirements. Conclusion The centrifugal column method combined with the qPCR probe method can be used to quantitatively determine residual DNA in cephalosporin antibiotics simply， quickly and accurately. The specificity， linearity， accuracy and precision of the method can meet the requirements of method verification. It is suitable for the detection of residual DNA in cephalosporin products and has reference significance for the quality control of other fermented and semi-synthetic antibiotics.

Key words Fluorescence quantitative PCR; Cephalosporin products; Fermented or semi-synthetic antibiotics; Residual DNA

頭孢類抗生素是臨床中最重要的抗菌藥物，目前絕大部分頭孢類抗生素都以產黃枝頂孢霉（頂頭孢霉Acremonium chrysogenum）發酵產生的頭孢菌素C為原料，通過青霉素G酰基轉移酶（penicillin G acylase， PGA）半合成或化學修飾改造而成[1-5]，因此終產品中可能會殘留有工業微生物來源的DNA。宿主殘留DNA是一種潛在的風險，主要是具有感染性和致瘤性[6-8]。因此，有必要建立專屬性強、靈敏度高和精密度好的分析方法，對抗生素藥品中發酵殘留物進行有效控制，以保證產品質量安全。

歐洲藥品局（European Medicines Agency， EMA）對進口歐盟國家及歐洲市場的發酵類產品，要求企業在進口申報資料中提供對殘留大分子物質的檢測結果，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration， FDA） 和歐洲藥品質量與健康管理局（European Directorate for The Quality of Medicines& HealthCare， EDQM） 也對于發酵類產品中的殘留物也做了相應規定[9]。我國現行版藥典并未要求檢測抗生素發酵殘留，但國家藥品監督管理局（Nation Medical Products Administration， NMPA）要求抗生素一致性評價申報資料中必須提供殘留大分子檢測數據。

雖然多國都對抗生素中殘留大分子提出檢測的要求，但目前國際上尚無統一的檢驗方法及標準，王琰等[9-10]采用高效液相熒光色譜法和蛋白芯片電泳技術建立了發酵類抗生素中殘留蛋白通用性測定方法，許明哲等[11]采用凝膠過濾色譜和Bradford法測定抗生素中蛋白殘留量，但抗生素中殘留DNA的檢測還處于研究初期，目前常用DNA熒光檢測法藥物中殘留DNA，但該法的靈敏度較低，且不能特異性檢測宿主殘留的DNA，專屬性較差[12-13]；相比于已有方法，熒光實時定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測方法具有專屬性強和靈敏度高的特點，對目標宿主細胞殘留DNA的檢測準確性更強。因此采用qPCR方法進行抗生素中殘留DNA檢測的研究意義重大。

本方法根據頭孢類抗生素半合成生產工藝的特點，采用柱式游離DNA抽提試劑盒（離心柱法）提取供試品中殘留DNA。采用qPCR探針法檢測供試品中殘留DNA，以產黃枝頂孢霉基因組DNA為定量參考品，對供試品中殘留產黃枝頂孢霉菌DNA進行定量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

真菌基因組DNA提取試劑盒（批號：D3195010000I06V009），購自美國Omega公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（批號：AL11991A）、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（批號：AL13174A），購自日本Takara公司；Ezup柱式游離DNA抽提試劑盒（批號：H701KA0602）、Carrier RNA溶液（批號：IA11KA6632）、pH8.0 Tris緩沖液、DNA分子量標準Marker（500～15000 bp）（批號：I815KA7297）、DNA分子量標準Marker（50-1031bp：I805KA5783），購自上海生工生物工程有限公司；無菌帶濾芯低吸附槍頭，購自中國LABSELECT公司；無菌低吸附離心管和PCR八聯管，購自美國AXYGEN公司；分析純的氯仿、異戊醇、無水乙醇和氫氧化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司。馬鈴薯葡萄糖液體培養基（批號：1101412）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（批號：1101411）、營養肉湯培養基（批號：1105551）、營養瓊脂（批號：1090401），購自廣東環凱微生物科技有限公司；超純水由Millipore 純水儀制備。

CFX96 Touch熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；BY-G16型高速醫用離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；NTC200干式恒溫器（上海皓莊儀器有限公司）；BSC-1304II A2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Mettler Toledo XS105DU十萬分之一電子天平（美國Mettler Toledo公司）；Nanodrop One超微量可見分光光度計（美國Thermo公司）。

1.2 菌種

產黃枝頂孢霉（菌種編號：CGMCC3.2853，等同于ATCC11550），購自中國普通微生物菌種保藏中心；產黃青霉（Penicillium chrysogenum）（菌種編號：CICC40654，等同于ATCC10106），購自中國工業微生物菌種保藏中心；大腸埃希菌（Escherichia coli）（菌種編號：CMCC（B）44102）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis） （菌種編號：CMCC（B）63501），購自中國微生物菌種保藏中心。

1.3 供試品

7-ACA原料、注射用頭孢呋辛鈉、注射用頭孢唑林鈉、注射用頭孢尼西鈉和注射用頭孢唑肟鈉等5種頭孢菌素類供試品由泰州市藥品檢驗院提供。

1.4 菌種基因組DNA提取

1.4.1 產黃枝頂孢霉DNA提取

按菌種說明書要求進行菌種復蘇、傳代，在馬鈴薯瓊脂平板上劃線得到單菌落，挑取單菌落加入馬鈴薯葡萄糖液體培養基，28 ℃振蕩培養5～7 d，取約20 mL菌懸液，用無菌濾紙過濾得到約200 mg的菌體，加液氮研磨至粉末狀，用接種鏟轉移至1.5 mL無菌離心管中，按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.4.2 其他菌種DNA提取

產黃青霉DNA提取同“1.4.1”；大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的DNA提取按菌種說明書要求進行菌種復蘇，在營養瓊脂平板上劃線得到單菌落，挑取單菌落加入營養肉湯培養基，37 ℃振蕩培養24 h，取1 mL菌懸液至1.5 mL離心管中，12000 g離心得到菌體，按照細菌DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA。

1.4.3 菌種基因組DNA濃度測定

參考現有的qPCR方法建立的相關文獻[14-16]，使用Nanodrop One超微量可見分光光度計測定上述4種菌種基因組DNA的濃度，產黃枝頂孢霉基因組DNA濃度在10～30 ng/μL之間， A260/A280為1.7～2.0，基因組DNA純度較好。

1.5 引物和探針的設計與合成

根據NCBI檢索得到的產黃枝頂孢霉18S rRNA核酸序列（NG_062810.1）保守區域設計熒光引物和探針，通過NCBI檢索引物和探針的特異性，在NCBI中選擇與產黃枝頂孢霉同屬及近源種屬的交織頂孢霉（Acremonium implicatum）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、墻支頂孢（Acremonium murorum）、分枝枝頂孢（Acremonium furcatum）、彎曲枝頂孢（Acremonium curvulum）、鐮狀枝頂孢（Acremonium kiliense）、互生枝頂孢（Acremonium alternatum）、頂青霉（Penicillium corylophilium）、網孢青霉（Penicillium reticulisporum）、平山青霉（Penicillium hirayamae）、產紅青霉（Penicillium rubens）、桔青霉（Penicillium citrinum）、波蘭青霉（Penicillium polonicum）、宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）、灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、臭曲霉（Aspergillus foetidus）等20種霉菌的基因進行比對，NCBI-Blast 結果顯示引物和探針均具有較高特異性，只特異性擴增產黃枝頂孢霉的18S rRNA核酸序列。引物及探針序列如表1所示，由生工生物工程（上海）公司合成。

1.6 溶液的制備

1.6.1 標準DNA溶液的制備

取已知濃度產黃枝頂孢霉基因組DNA提取液適量，用pH 8.0的Tris緩沖液（稀釋液）稀釋成10 ng/μL的溶液，作為標準DNA儲備液，用pH 8.0的Tris緩沖液逐步稀釋為稀釋成濃度分別為1000 pg/μL（ST1）、100 pg/μL（ST2）、10 pg/μL（ST3）、1pg/μL（ST4）、100 fg/μL（ST5）、10 fg/μL（ST6）的溶液，作為標準DNA溶液，以制備標準曲線及加樣回收用。

1.6.2 供試品溶液的制備

每個供試品稱取200 mg，溶于10 mL稀釋液中，制備成20 mg/mL溶液，作為供試品溶液，如供試品不能完全溶解，可加入適量2 mol/L的氫氧化鈉溶液助溶，精密量取200 μL至干凈的1.5 mL離心管中備用。

1.6.3 加標回收供試品溶液的制備

分別精密量取200 μL供試品溶液及稀釋液至干凈的1.5 mL離心管，按表2加入標準DNA溶液，作為加標回收供試品溶液和陽性質控PCS溶液。

1.6.4 陰性質控溶液的制備

取稀釋液200 μL，作為陰性質控NCS。

1.7 供試品溶液前處理

按照柱式游離DNA抽提試劑盒說明書的要求對供試品溶液、加標回收溶液和陰性質控溶液進行前處理，按照以下公式添加適量體積的Carrier RNA溶液，A=10（-0.5lgB）（A為Carrier RNA溶液添加的體積，單位：μL；B為加標量，單位：pg；添加量小于0.1 μL時忽略不計）以提高DNA回收效率，得到終體積為100 μL的供試品純化液。

1.8 qPCR測定方法

1.8.1 qPCR反應體系的制備

將qPCR引物、探針、Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）試劑提前半小時取出融化，輕微震蕩混勻，按表3配制qPCR反應體系，每個供試品檢測3個重復；

1.8.2 qPCR程序

選擇探針方法，選擇報告熒光基團為FAM，猝滅熒光基團為none。設置兩步法反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；反應體積25 μL。

1.8.3 數據分析

qPCR 運行結束后，在結果分析窗口自動設置閾值，用標準DNA溶液擴增達到熒光閾值的循環數，即循環閾值（cycle threshold，Ct）對DNA濃度繪制標準曲線，將待測供試品的Ct值代入方程，計算其初始濃度。參考2020年版《中國藥典》3407外源性DNA殘留量測定法的相關規定，設定系統適用性及可接受標準為：標準曲線決定系數（R2）≥ 0.990；PCR擴增效率90%～110%，質控供試品回收率：50%～150%，供試品3個重復的相對標準偏差（RSD）≤30%。

殘留量（pg/g）=（供試品檢測值（pg/μL）×100/供試品濃度/0.2×1000

其中，供試品檢測值單位為pg/μL，100為供試品溶液前處理終體積（μL），0.2為供試品溶液取用體積（mL），供試品溶液濃度單位為mg/mL，1000為mg與g之間的單位換算。

回收率（%）=（加標供試品檢測值-供試品檢測值）×100/理論加標量×100%，其中，100為供試品溶液前處理終體積（μL）。

1.9 方法學研究

1.9.1 線性和范圍

取“1.6.1”標準DNA溶液各10 μL，采用“1.8”方法進行qPCR，做線性和范圍的分析，根據標準DNA溶液線性考察結果確定檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.9.2 專屬性

在“1.5”引物和探針設計中已充分考慮引物特異性，NCBI-Blast結果顯示二者均具有較高特異性，在此僅對實驗室常用的產黃青霉、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌3種微生物基因組DNA進行檢測，取產黃枝頂孢霉及產黃青霉、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌基因組DNA，分別稀釋至1 ng/μL，并設立陰性對照（NCS），按照“1.8”方法檢測，補充評估該方法的專屬性。

1.9.3 準確度

取5種頭孢類產品，按照“1.6.3”方法分別制備高、中、低3種濃度的加樣回收溶液和陽性質控，按照“1.7”方法處理得到加樣回收純化液，采用“1.8”方法檢測加樣回收溶液中DNA含量，并計算回收率。

1.9.4 重復性和精密度

以B202212165批7-ACA原料為代表供試品，考察日內和日間精密度，在3個不同日期分別按“1.6.2”方法制備供試品溶液，按“1.6.3”方法加入10 μL ST5，加標量為1 pg ，按照“1.7”方法處理得到加樣回收純化液，采用“1.8”方法檢測，分別重復3次檢測，計算其RSD。

1.10 方法的應用

應用建立的方法對5種頭孢類產品中產黃枝頂孢霉殘留DNA進行檢測，按照“1.6.2”方法制備供試品溶液，“1.7”方法處理得到供試品純化液，采用“1.8”方法檢測供試品溶液中DNA含量。

2 結果

2.1 方法學驗證結果

2.1.1 線性與范圍

線性結果顯示在DNA含量為10 fg/μL～1 ng/μL的范圍內，線性關系良好，建立標準曲線，得到方程 Y=27.671-3.196×logX（Y為標準DNA溶液的Ct值，X 為標準DNA溶液的濃度），相關系數R2=0.997，擴增效率為105.5%（圖1）。根據標準DNA溶液線性考察結果分析，標準DNA溶液終濃度為10 fg/μL時，以供試品濃度20 mg/mL計，相當于250 pg/g，以此濃度作為標準DNA溶液在供試品溶液中的LOQ，以LOQ的三分之一作為LOD，以供試品濃度20 mg/mL計，相當于83 pg/g。根據2020年版《中國藥典》及《人用重組DNA制品質量控制要點》的相關規定，生物制品殘留DNA的檢出限一般為10 ng/劑～100 pg/劑[17-18]，參考生物制品的殘留DNA檢出限，本方法的檢出限可滿足檢測需求。

2.1.2 專屬性

取產黃枝頂孢霉及產黃青霉、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌基因組DNA，進行qPCR擴增，結果顯示，產黃枝頂孢霉擴增情況良好，產黃青霉、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌基因組DNA均未能擴增，NCS未檢出（圖2）。綜上所述，建立的qPCR方法專屬性良好。

2.1.3 準確度

按照“1.9.3”驗證準確度，各品種的3個不同濃度的加樣回收結果均符合要求，在50%～150%之間；PCS的回收率在50%～150%之間（表4），準確度結果良好。

2.1.4 重復性和精密度

以B202212165批7-ACA原料為代表供試品，考察日內和日間精密度，按照“1.9.4”方案，由實驗員不同日期對低濃度供試品進行回收提取并檢測，考察日內和日間實驗濃度RSD值，結果見表5，結果顯示，供試品日內和日間RSD值在30%以下，符合重復性和精密度要求。

2.2 供試品測定結果

頭孢類產品中產黃枝頂孢霉殘留DNA檢測結果見表6，結果顯示，5批供試品中的產黃枝頂孢霉菌殘留DNA均在檢測限以下。

3 討論

發酵類和半合成類抗生素會面臨類似宿主細胞來源DNA殘留所帶來的潛在風險，因此，需嚴格控制殘留DNA含量。近年來，由于qPCR檢測殘留DNA更加快速、靈敏，該方法逐漸應用于殘留DNA含量的檢測，2020年版《中國藥典》將qPCR法加入殘留DNA含量的檢測，并規定不同品種的生物制品中殘留DNA的限度要求為10 ng/劑～100 pg/劑，基于CHO細胞基質的疫苗在原液階段的殘留DNA含量不高于10 pg/劑[17]。《人用重組DNA制品質量控制要點》中要求必須用敏感的方法測定來源于宿主細胞的殘余 DNA含量，這對于用哺乳動物傳代細胞（ 轉化的細胞系） 生產的制品尤為重要，一般認為殘余DNA含量小于100 pg/劑是安全的[18]。目前尚無針對發酵類和半合成類抗生素的殘留DNA規定。考慮頭孢類產品一般使用工程菌發酵，與連續傳代的腫瘤細胞株相比，其安全性相對較高，因此可參考非腫瘤細胞株的宿主殘留DNA的規定[17]，將其殘留安全劑量制定為10 ng/劑。

本研究開發了離心柱法結合qPCR探針法對5種頭孢類產品中殘留DNA含量進行檢測，并進行了方法學驗證，結果顯示，方法的專屬性、線性、準確度、重復性、精密度等各項指標均可達到方法驗證的要求，方法檢測限低至83 pg/g，遠低于10 ng/劑的安全劑量，可以滿足頭孢類產品宿主殘留DNA的檢測需求。由于產黃枝頂孢霉基因組DNA尚無法定標準品，本研究所用的標準品DNA為實驗室提取的產黃枝頂孢霉基因組DNA，采用Nanodrop One超微量可見分光光度計測定其濃度，可能存在標準DNA濃度測定不準確的問題，因此本文建立的qPCR僅能相對定量，下一步需要采取更加準確的濃度方法測定產黃枝頂孢霉基因組DNA濃度，并做進一步研究；另外，本文僅采用5種頭孢類產品進行方法學驗證和檢測，下一步將擴大引物設計選擇和驗證規模，選取不同廠家的多種頭孢類產品、半成品和發酵原液，檢測其殘留DNA水平，為頭孢類抗生素中殘留DNA檢測提供合理且客觀的質量標準數據。

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