趨化因子受體CXCR2在腹主動脈瘤中的表達及其臨床意義

劉 超，岳陽陽，張孟釗，劉 爽，李小兵，李 延

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)是炎癥、氧化應激等因素所致腹主動脈不可逆擴張，隨著瘤體直徑增大，破裂風險增加，瘤體一旦破裂，病死率可達80%以上[1]。目前，臨床治療AAA以手術或介入治療為主，尚無藥物治療方法，深入了解其發病機制，尋找有效治療靶點，可為臨床治療提供新的思路和方向[2]。中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤是AAA的主要病理機制之一，研究發現，趨化因子在腹主動脈壁炎性細胞黏附聚集過程中發揮重要作用[3]。CXC趨化因子受體2(CXCR2)是CXC趨化因子受體家族成員，在炎性細胞中廣泛表達，介導疾病的炎癥反應過程，故推測其可能參與AAA的發生與發展，但目前CXCR2與AAA關系的相關研究較少[4]。除此之外，基質金屬蛋白酶(MMPs)所介導的膠原蛋白與彈力纖維降解也是AAA的重要病理機制之一[5]。本研究旨在分析AAA組織CXCR2表達及其與已知炎性細胞因子基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的關系，以深入了解AAA的發病機制，為臨床診治提供新的思路和方向，詳述如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2019年7月—2022年7月我院80例AAA作為觀察組。①納入標準：經影像學檢查及手術病理證實為AAA；患者知情同意并自愿配合。②排除標準：存在自身免疫性疾病、感染性疾病者；近期應用免疫抑制劑、糖皮質激素類藥物者；臨床資料不完整者。另選取同時期行腹動脈-股動脈移植術者40例作為對照組。觀察組男44例，女36例；年齡31～68(56.27±8.45)歲。對照組男24例，女16例；年齡29～66(55.76±6.80)歲。2組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集：留取觀察組術中AAA前壁組織及對照組腹前動脈血管吻合處正常動脈壁組織，甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，-80 ℃凍存待檢。

1.2.2免疫組織化學檢測[6]：二甲苯、梯度酒精脫蠟脫水，PBS緩沖液沖洗，加3%過氧化氫甲醇液、3%山羊血清封閉液，依次加CXCR2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體，4 ℃過夜。PBS緩沖液沖洗，加二抗，37 ℃孵育50 min。二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染。400倍鏡下，隨機選擇5個視野觀察，統計陽性細胞的占比。陽性細胞占比評分：無陽性細胞計0分，陽性細胞占比<25%計1分，25%≤陽性細胞占比≤50%計2分，50%<陽性細胞占比<75%計3分，陽性細胞占比≥75%計4分。染色強度評分：無染色計0分，輕度染色計1分，中度染色計2分，重度染色計3分。總分=陽性細胞占比評分×染色強度評分，總分>3分為陽性，否則為陰性。

1.2.3蛋白免疫印跡法：組織樣本加入蛋白提取液制成勻漿，4 ℃過夜，15 000 r/min離心50 min分離上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo)，測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，各泳道加入30 μg蛋白上清液，轉移至PVDF膜，加5%脫脂牛奶，封閉放置2 h。分別加入CXCR2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體，4 ℃封閉放置過夜；PBS緩沖液沖洗，加入稀釋至1∶5000辣根過氧化物酶標記的馬抗鼠IgG二抗(美國Sigma)，37 ℃孵育2 h。PBS緩沖液沖洗，加入ECL化學發光顯影試劑(上海杰美基因醫藥科技)，分析目的條帶光密度值。

1.2.4RT-PCR：采用TRIzol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA，采用紫外分光光度法測定總RNA濃度。取1 μg總RNA，RNA逆轉錄模板1 μl，逆轉錄緩沖液3 μl，逆轉錄酶2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加雙蒸水至20 μl總反應體系，37 ℃反應50 min，逆轉錄為cDNA，試劑盒購自美國Promega公司。PCR反應體系：cDNA 2.5 μl，PCR試劑混合液12.5 μl，DEPC 8 μl，上下游引物各1 μl。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環40次，72 ℃延伸5 min。引物序列：CXCR2上游：5'-CAGCGACCCAGTCAGGATTTA-3'，下游：5'-ACCAGCATCACGAGGGAGTTT-3'，擴增片段長度251 bp；MMP-9上游：5'-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3'，下游：5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAAATGG-3'，擴增片段長度317 bp；內參引物序列上游：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，下游：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，擴增片段長度318 bp，均由北京三博遠志公司提供。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增片段，分析基因相對表達量。

1.3觀察指標 比較2組CXCR2、MMP-9蛋白表達及mRNA表達水平。比較不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達情況，并分析CXCR2與MMP-9蛋白表達的相關性。

2 結果

2.1CXCR2、MMP-9蛋白表達陽性率比較 免疫組織化學檢測結果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9蛋白表達陽性率均高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組不同組織CXCR2、MMP-9蛋白表達陽性率比較[例(%)]

2.2CXCR2、MMP-9蛋白表達量比較 蛋白免疫印跡法結果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9蛋白表達量均高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 2組不同組織CXCR2、MMP-9蛋白表達量比較

2.3CXCR2、MMP-9 mRNA相對表達量比較 RT-PCR結果顯示，觀察組CXCR2、MMP-9 mRNA相對表達量均高于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 2組不同組織CXCR2、MMP-9 mRNA相對表達量比較

2.4不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達情況比較 瘤體直徑≥5 cm、有心腦血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表達陽性率分別高于瘤體直徑<5 cm、無心腦血管意外史患者(P<0.01，P<0.05)。見表4。

表4 不同臨床病理特征AAA患者CXCR2蛋白表達情況比較[例(%)]

2.5CXCR2與MMP-9蛋白表達量相關性分析 Pearson相關性分析顯示，CXCR2與MMP-9蛋白表達量呈正相關(r=0.547，P<0.001)。

3 討論

AAA發生是一個慢性過程，其中一個重要環節是單核細胞募集至腹主動脈內壁，并進入外膜，引發炎癥反應，在炎性細胞的趨化過程中，趨化因子發揮重要作用[7]。CXCR2是G蛋白耦聯受體超家族成員，在單核巨噬細胞、中性粒細胞表面表達，刺激炎性細胞的趨化[8]。既往研究證實，CXCR2與動脈粥樣硬化密切相關，而動脈粥樣硬化又是AAA的已知危險因素之一，故推測CXCR2可能參與AAA的發生與發展[9]。本研究結果顯示，AAA組織CXCR2蛋白表達陽性率高于正常動脈壁組織，AAA組織CXCR2蛋白表達量高于正常動脈壁組織，AAA組織CXCR2 mRNA相對表達量高于正常動脈壁組織，這一結果與既往研究相符[10]，證實CXCR2在AAA組織中高表達，提示其可能參與AAA的發生。

針對AAA患者臨床病理特征的分析顯示，瘤體直徑≥5 cm和有心腦血管意外史AAA患者CXCR2蛋白表達陽性率分別高于瘤體直徑<5 cm和無心腦血管意外史患者，表明CXCR2蛋白表達升高提示患者處于病情更嚴重、風險更高的狀態。AAA的組織學改變以腹主動脈壁膠原降解、炎性細胞浸潤、血管新生等為主[11]。腹主動脈細胞外基質以膠原、彈力蛋白為主要成分，二者的合成與降解在正常生理狀態下可保持動態平衡，進而維持腹主動脈正常的結構功能[12]。而病理狀態下，炎性細胞分泌大量MMPs，使膠原酶激活，膠原蛋白分解加速，導致腹主動脈持續擴張[13]。MMPs是以鈣離子、鋅離子為輔助因子的蛋白水解酶，可降解細胞外基質中的蛋白成分，在組織重構、炎癥反應及心血管疾病、惡性腫瘤中起關鍵作用。MMP-9可促進彈力蛋白降解，降解產物可趨化白細胞，進一步導致炎性細胞浸潤，促成AAA的發生與發展。有研究證實，AAA血管壁中MMP-9表達上調，參與慢性炎癥反應，進而介導血管重塑[14]。本研究Pearson相關性分析發現，CXCR2與MMP-9蛋白表達量呈正相關，表明CXCR2表達上調可能通過靶向調控MMP-9過表達，進而參與AAA的發生與發展。

綜上所述，CXCR2、MMP-9在AAA患者主動脈瘤組織中表達上調，且CXCR2與MMP-9蛋白表達量具有正相關性，CXCR2可能通過調節MMP-9的表達，參與炎性細胞浸潤與慢性炎癥反應，進而促進AAA的發生與病情進展。