乳腺癌前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與前哨淋巴結轉移的關系及意義

馬友龍，張 敏

腋窩淋巴結狀態是評估乳腺癌預后、制定治療方案的重要參考[1]。腋窩前哨淋巴結活檢已替代腋窩淋巴結清掃成為前哨淋巴結陰性患者腋窩根治性手術的主要方式，是乳腺外科領域里程碑式的進展；當前哨淋巴結陽性時，推薦行腋窩淋巴結清掃，不僅能達到良好的治療效果，還能避免過度治療或治療不足，故準確評估腋窩淋巴結狀態意義重大[2-3]。對于早期浸潤性乳腺癌，即使患者臨床特征相似，其前哨淋巴結轉移(SLNM)情況仍不盡相同，提示某些潛在的機制影響了SLNM與否，而目前臨床對此了解有限，所以有必要進一步研究，以闡明其機制。八聚體結合轉錄因子-4(Oct-4)定位于6號染色體的短臂21位，可通過結合DNA上靶序列行使其功能，在體外乳腺癌細胞中Oct-4表達升高，并能促進乳腺癌干細胞的上皮間質轉化和轉移，高表達的Oct-4與患者不良預后密切相關[4]。血管內皮生長因子-D(VEGF-D)是促血管新生因子之一，高水平VEGF-D能促進膀胱癌等癌癥淋巴管生成和淋巴結轉移，成為淋巴結轉移的一個主要途徑[5]。L-選擇素(L-selectin)可結合特定糖基，是黏附分子選擇素家族成員，在肺癌中表達升高，與無淋巴結轉移患者相比，存在淋巴結轉移患者L-selectin表達進一步升高[6-7]。本研究探討乳腺癌前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與SLNM的關系及意義，以期為深入認識并準確評估SLNM提供參考。

1 資料與方法

1.1納入與排除標準 ①納入標準：符合乳腺癌診斷標準[8]；早期浸潤性乳腺癌；無相關治療史。②排除標準：示蹤劑過敏；炎性乳腺癌；經穿刺活檢明確存在腋窩淋巴結轉移，未經新輔助化療直接手術；不能耐受腋窩前哨淋巴結活檢；認知、意識等異常，不能配合本研究。

1.2一般資料 選取2020年4月—2022年7月我院收治的147例乳腺癌為研究對象，采用腋窩前哨淋巴結活檢術判斷SLNM。將無轉移及孤立的腫瘤細胞群定義為無SLNM，微轉移、宏轉移定義為SLNM；其中無轉移為切片中未找到腫瘤細胞；孤立的腫瘤細胞群為腫瘤細胞散在單個或腫瘤沉積灶最大徑≤0.2 mm；1個淋巴結切面上腫瘤細胞≤200個，分期為pN0期；微轉移為1個淋巴結切面上>200個腫瘤細胞或腫瘤沉積灶最大徑0.2～2.0 mm，分期為pN1期；宏轉移為分期pN1期及以上，腫瘤沉積灶最大徑>2.0 mm[9]。根據SLNM情況分為SLNM組67例及無SLNM組80例。SLNM組中58例進行了腋窩淋巴結清掃，術中病理學診斷結果提示SLNM，9例根據前哨淋巴結陽性枚數及綜合治療方案判定，未行腋窩淋巴結清掃；無SLNM組均未行腋窩淋巴結清掃。本研究遵循《世界醫學協會赫爾辛基宣言》要求。

1.3方法

1.3.1資料收集：采用一般資料調查表收集患者體質量指數、年齡、絕經情況、T分期、腫瘤直徑、區域淋巴結分期、患病側別、腫瘤位置，其中T分期、區域淋巴結分期參考第8版美國癌癥聯合委員會乳腺癌分期。

1.3.2主要試劑與儀器：聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑(美國santasanta公司，貨號2016002#)；勻漿緩沖液(美國santasanta公司，貨號2018139#)；轉膜緩沖液(英國IAbcam公司，貨號7190051#)；考馬斯亮藍膜染色液(加拿大Fermentas公司，貨號3065812#)；DAB顯色液(加拿大Fermentas公司，貨號2018924#)；一抗、二抗(加拿大Fermentas公司，貨號2015418#、2015437#)；電泳儀(美國伯樂公司)；雙色紅外激光成像系統(美國LI-COR公司Odyssey型)；低溫冷凍離心機(德國艾本德股份公司)；多功能酶標儀(美國MD公司FLEXSTATION 3型)。

1.3.3指標檢測：通過腋窩前哨淋巴結活檢術獲取前哨淋巴結標本，采用免疫蛋白印跡法檢測前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平，使用組織剪刀將標本剪碎，置于勻漿器中，加入裂解液勻漿，冰上裂解。取出預先準備好的聚丙烯酰胺凝膠，裝好電泳槽，加電泳液，5 min內完成上樣，立即電泳，轉膜，考馬斯亮藍染膠，5%脫脂奶常溫封閉2 h，切膜，按照1∶1000的比例加入一抗常溫孵育2 h，洗膜，按照1∶5000的比例加入二抗常溫孵育2 h，洗膜，曝光顯影，Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平以內參的相對表達量表示。

2 結果

2.1人口學資料與臨床特征比較 SLNM組在體質量指數、年齡、絕經情況、T分期、腫瘤直徑、患病側別、腫瘤位置方面與無SLNM組比較差異無統計學意義(P>0.05)；SLNM組區域淋巴結分期與無SLNM組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組乳腺癌人口學資料與臨床特征比較

2.2前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比較 SLNM組前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平高于無SLNM組(P<0.01)。見表2。

表2 2組乳腺癌前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比較

2.3前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與T分期和區域淋巴結分期的關系 隨著T分期和區域淋巴結分期升高，前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3和表4。

2.4多因素Logistic回歸分析 將前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin作為自變量，連續變量按實際值賦值；將SLNM情況作為因變量，賦值：無SLNM=0，有SLNM=1。分析結果顯示，前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin均是乳腺癌患者SLNM的獨立危險因素(P<0.01)。見表5。

表3 乳腺癌患者前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與T分期的關系

表4 乳腺癌患者前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與區域淋巴結分期的關系

表5 乳腺癌患者SLNM的多因素Logistic回歸分析

2.5前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者聯合評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線和CIC分析 繪制前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線，發現Oct-4、VEGF-D、L-selectin的獲益均高于所有患者不治療(凈獲益為0的全陰性線)以及所有患者接受治療(凈獲益為負值的反斜線)，提示采用Oct-4、VEGF-D、L-selectin評估乳腺癌患者SLNM的臨床效用良好，臨床效用排序：Oct-4、L-selectin、VEGF-D；以相似的方法繪制三者聯合評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線，發現三者聯合較單獨指標評估乳腺癌患者SLNM的臨床獲益度均明顯升高。見圖1。進一步繪制CIC顯示，閾概率值>0.6時，三者聯合評估乳腺癌患者SLNM與實際情況具有較高的符合率。見圖2。

圖1 前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者聯合評估乳腺癌患者SLNM的決策曲線分析

圖2 Oct-4、VEGF-D、L-selectin聯合評估乳腺癌患者SLNM的臨床影響曲線分析

3 討論

Oct-4由C端結構域、N端結構域、POU結構域組成，除結合DNA外，還能與轉錄因子SOX2等形成復合物，發揮轉錄因子的功能[10-12]。JAHANGIRI等[13]報道，乳腺癌患者Oct-4表達顯著升高。本研究結果顯示，SLNM組前哨淋巴結中Oct-4高于無SLNM組，表明與SLNM有關。展暉等[14]研究發現，下調Oct-4的表達能明顯抑制食管癌細胞的活力及侵襲、遷移能力，上調Oct-4則能促進癌細胞的侵襲與遷移。Oct-4在侵襲性較低的癌細胞中也存在高表達現象，采用基因靶向技術沉默Oct-4表達，可誘導上皮間質轉化，并伴有細胞遷移和浸潤能力的增加，提示Oct-4與癌細胞轉移有關[15-16]，與本研究觀點存在相似之處。分析其原因發現，高表達Oct-4可增強乳腺癌細胞干性，通過影響細胞骨架重組、上皮間質轉化、賦予細胞極性等多個途徑，增強乳腺癌細胞的遷移和浸潤能力，從而調控腫瘤轉移[17]。本研究發現，隨著T分期和區域淋巴結分期升高，前哨淋巴結中Oct-4水平逐漸升高，與熱孜宛古麗·約麥爾等[18]報道的Oct-4表達與宮頸癌分期呈正相關的結論相似，表明Oct-4還與腫瘤分期有關。本研究發現使用前哨淋巴結中Oct-4評估SLNM時，有良好的正向凈獲益，能為臨床制定后續的治療方案提供參考。

VEGF-D系血管內皮家族成員之一，是該家族中與腫瘤血管和淋巴結管生成關系最密切的因子[19-21]。SLNM是乳腺癌區域及遠處淋巴結轉移的“第一站”，作為一種早期事件，其具有重要的預警意義。本研究發現，存在SLNM患者VEGF-D水平明顯高于無SLNM患者，是乳腺癌患者SLNM的獨立危險因素，具有作為預警標志物的潛在價值。TANIGUCHI等[22]報道，轉移性結腸癌患者VEGF-D高于無轉移患者，證實VEGF-D與癌細胞轉移有關。VEGF-D促進淋巴管和血管新生的作用，能為乳腺癌SLNM提供有利條件，且在SLNM前即能檢測到顯著高表達的VEGF-D，這意味著早在SLNM前就有新生淋巴管產生，所以檢測前哨淋巴結中VEGF-D表達，能為早期預測SLNM提供一定參考[23]。本研究后續分析顯示，VEGF-D評估SLNM均有正向的凈獲益，可作為評估SLNM的標志物。隨著T分期和區域淋巴結分期升高，VEGF-D表達逐漸升高，還能為臨床評估乳腺癌分期提供參考信息。

L-selectin擁有類似凝集素樣的細胞外結構，能與細胞表面糖蛋白相互作用，以鈣依賴的方式，介導轉移過程中循環癌細胞與血管、淋巴管的黏附[24-25]。本研究結果顯示，SLNM組前哨淋巴結中L-selectin水平高于無SLNM組，表明L-selectin表達具有淋巴結趨向性特點，可能在促進SLNM中發揮重要作用，且能作為分子標志物評估乳腺癌SLNM狀態。現階段L-selectin淋巴結趨向性表達的機制尚未完全闡明，結合相關資料分析，外周淋巴結的高內皮微靜脈表面表達L-selectin的其他配體，如硫化糖蛋白，與周圍淋巴結內配體相互作用，促使癌細胞在該位置黏附定植，同時激活細胞內鈣動員過程，誘導腫瘤細胞的趨化、黏附，從而調控SLNM[26-27]。同時本研究還發現，隨著T分期和區域淋巴結分期升高，前哨淋巴結中L-selectin水平逐漸升高，提示L-selectin與乳腺癌分期有關。應用L-selectin評估乳腺癌患者SLNM，與Oct-4、VEGF-D一樣，也有正向的凈獲益，但Oct-4、VEGF-D、L-selectin聯合評估的臨床獲益度高于單獨指標評估，提示三者聯合評估能提高臨床效用。閾概率值>0.6時，三者聯合評估乳腺癌患者SLNM與實際情況具有較高的符合率，體現出較高的評價能力，因此建議臨床應聯合應用進行評估SLNM。

綜上所述，乳腺癌前哨淋巴結中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平均與SLNM及腫瘤分期有關，是患者發生SLNM的一個潛在機制，三者聯合評估SLNM具有良好的臨床獲益度，可作為評估乳腺癌患者SLNM的可靠方法。