煙草增香生物技術研究進展*

孫福艷，楊雪鵬，楊 成，王 龍，劉志宏，曾 祥，盧玉松，楊 楠

(1.湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430000;2.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000)

煙草中的淀粉、蛋白質、纖維素等燃燒產生大量有害物質，危害身體健康，也降低卷煙品質。降焦減害、提高卷煙的安全性成為煙草行業的共同目標，但煙草香味物質很大一部分存在于焦油中，降焦減害同時也使卷煙香味物質不同程度的流失，難以滿足消費者抽吸需求，進而影響卷煙的銷售。

目前，增香方法主要有：①物理方法。如微波處理煙梗，能增加雜環類物質，即煙草典型香味化合物的含量[1]，但大量耗能，很難實現大規模應用；直接提取芳香植物或動物中的天然揮發性物質，但原料有限、成本高、產量低，不能滿足市場需求。②化學合成。香味物質合成周期短且純度高，但香氣單一、安全性低且許多優良香氣成分不能規模化生產。③生物方法。產香功能的微生物發酵或者生物轉化產香[2]，微生物利用天然原料發酵產香，綠色安全、香味物質品質高、反應條件溫和、周期短[2-3]。因此煙草行業專家紛紛將微生物增香作為研究的重點。

微生物產香種類豐富，如芽孢桿菌發酵可增加醇香、果香、甜香、辛香、蜂蜜香、醋酸香和醬香等特征香氣；酵母發酵可產生玫瑰香、蟠桃香等花果香[4]。微生物產生的一系列高活性酶系會將底物分解、轉化為復雜的小分子化合物，如醇類、酮類、酯類、呋喃類等香味化合物，煙草的香味就是這類物質凸顯出來的。通過篩選特定產香菌、優化培養基及發酵條件，定向產生煙草香氣物質[5]。相關研究表明，氧化作用、微生物作用及酶作用是煙葉發酵三大機理[6]。在煙葉發酵中，添加微生物或酶制劑，卷煙的雜氣、刺激性降低，香氣量、香氣質、吸味醇度等均有提升[7]。

目前煙草生物技術增香主要分為：①添加煙草香精香料，彌補了香氣不足，突出卷煙風格，利于品牌穩定發展[8]。目前主要通過調控發酵條件、基因工程改造等生產煙用香料，制備較多的煙用香料如香蘭素、2-苯乙醇等單體香料，胡蘿卜素降解香料、多糖類及其他復合香料[9]。②將有益產香微生物或生物酶制劑接種于煙葉表面，使其在最優的發酵條件下產香，高效實用，安全專一，極具發展潛力[10]。

1 煙草增香微生物的種類和來源

煙草發酵過程中，煙葉表面存在大量的微生物，細菌的數量和種類均占絕對優勢，霉菌次之[10]。利用現代生物學手段將有益菌株篩選分離出來，將其應用于煙草發酵過程中，以此人為地達到增香提質目的。本文主要針對國內近10年內有關增香微生物種類、來源文獻進行綜述，文獻檢索策略主要是利用關鍵詞“煙草產香微生物”“煙草增香菌株”等進行檢索，并對檢索得到的文獻進一步的研讀與分析。結果如表1所示。

表1 增香微生物的種類及來源

表1(續)

從表1中可知，煙草增香微生物的種類多樣，分別為酵母菌、霉菌、細菌以及混合菌；酶的種類分為單一酶和混合酶，以及酶+微生物混合發酵增香。煙草增香菌主要是細菌和酵母，少數為霉菌；混合菌株仍以細菌和酵母菌居多，這與李秀妮、余玉莎等人的研究結果一致[10,24]。細菌以芽孢桿菌為優勢菌屬，酵母菌中產香酵母、釀酒酵母為優勢菌屬。芽孢桿菌代謝過程中產生大量胞外酶，經過酶催化轉化積累各種多肽、氨基酸和還原糖類以及乙偶姻、四甲基吡嗪等美拉德反應產物[76]。酵母菌具有優良的發酵及營養特性，可產生諸多風味物質，增香效果顯著，安全性也較強[77]。

煙草增香微生物來源分為煙草源微生物、非煙草源微生物。從表1中看出，增香微生物主要篩選自煙草源，煙葉表面篩選的比例最大，其次為煙草土壤和浸提液。煙草源微生物能很好的適應煙葉生化環境，可與煙葉內源微生物整體協調發酵，提升香氣質、香氣量，改善卷煙吸味品質，安全性高[78-79]。非煙草源微生物是指從非煙草環境中篩選出的微生物，此類微生物目前研究較少，主要是以食物為主，如葡萄、酒糟、酒曲、茶葉等。增香微生物從食源性材料中篩選，應用于煙草發酵，經過一系列生物化學反應，產生香味物質，整個過程綠色、安全。

酶制劑是從微生物中提取的具高催化活性的生物制品。從表1中看出，相比微生物發酵產香，添加酶制劑的研究較少，主要為單一酶、混合酶、微生物和酶聯合催化產香。單一酶有果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，針對性解決煙葉本身不足；復合酶種類較雜，且一般是三種及三種以上的酶共同催化產香，故催化產生的小分子香氣物質種類多，協調性好；增香微生物在生長過程中會產生一系列酶系，酶+微生物聯合催化產生香氣。研究表明，煙葉中淀粉、蛋白質、纖維素和果膠等在不完全燃燒時，顯著影響卷煙煙氣的焦油、氫氰酸、亞硝胺類、苯并[a]芘(B[a]P)等有毒有害物質的釋放量[58]。采用生物法酶解煙草中的蛋白質、果膠等大分子物質定向生成小分子增香，專一高效，提升煙葉整體品質及協調性。酶制劑一部分直接從生物酶有限公司購得，純度高，活性強；一部分由微生物發酵代謝產生濃縮所得，經濟實惠，產香豐富。

2 煙草增香微生物應用場景

本文對國內近十年來增香微生物在煙草領域的應用統一歸納總結，主要分為五類。

2.1 增香微生物與卷煙

利用生物學手段定向篩選微生物(或添加酶制劑)應用于卷煙增香較多，精準性高，專一性好，取得了一定的成效。王曉丹等篩選畢赤酵母發酵煙葉(發酵前切絲，或者切絲后發酵)，得到煙草帶玫瑰花香、粉香、蜂蜜樣香氣[19]。張知曉利用白地霉(G.candidum) 發酵煙葉，產生酯類、醇類、酮類等揮發性香味物質。李寧研究了蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)人工發酵雪茄煙葉，可以使雜氣減輕，香氣增加[22]。薛磊等篩選得到芽孢桿菌屬(Bacillussp.)發酵煙絲，煙氣香味物質含量、細膩度、甜感均增加[39]。曾婉俐等將甲基營養型芽孢桿菌應用于煙葉發酵，煙葉產生明顯奶香味[42]。于少藤等將假單胞菌yc10粗酶液用于煙葉發酵達到提質增香的效果[43]。Lan Yao等利用芽孢桿菌Bacillusvelezensis發酵雪茄茄葉，結果表明酮類香味物質顯著提高，茄葉香氣質和香氣量均提升[46]。蘇加坤等篩選產酶菌株(芽孢桿菌)添加到煙絲上進行陳化，卷煙的香氣更加充實、雜氣及刺激性降低、余味更凈[55]。楊婧等將多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶生物酶制劑加入煙絲中制成新型煙草制品，抽吸過程中生物酶在適宜的條件下作用于煙絲，使其快速碳化，散發煙香，結果表明加入生物酶產生致香物質的種類更多，含量更高，口感更好[70]。

2.2 增香微生物與煙用香料

利用微生物發酵生產純天然的煙用香料來彌補煙葉自身香氣缺陷，產生的香味物質豐富、醇和、與煙絲配伍性好。馬海昌利用耐高溫淀粉酶、糖化酶、復合植物水解酶處理煙梗制備煙用香料，GC-MS檢測結果顯示，糠醛、糠醇、茄酮等煙草典型致香成分含量增加，香氣濃郁而舒適[12]。鞏效偉等利用釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)KMLY1-2制備的電子煙煙液香氣諧調飽滿，余味干凈，抽吸品質好[20]。楊金初等利用耐高溫α-淀粉酶發酵制備甘薯浸膏，該浸膏(烤甜香)致香成分為美拉德/焦糖化反應產物，與卷煙煙絲存在良好的配伍性[64]。

2.3 增香微生物與低廢煙草

利用低等級煙葉(或煙草廢棄物)發酵增香，減小煙草低次原料的庫存壓力，充分利用煙草廢棄物(煙末、煙梗等)價值，提升經濟效益。吳長偉等利用貝萊斯芽孢桿菌HF-09(BacillusvelezensisHF-09) 固體發酵紅大煙梗(C3F)，結果表明該菌株能高效降解煙梗纖維素轉化生糖，菌株HF-09休止細胞發酵工藝的轉化效率和生香率更高[44]。伍雪瑩添加增香菌群處理低等級煙葉，結果表明，昆明菌群明顯提升了煙葉香氣質、香氣量及透發性[53]。郭林青等篩選得漢遜酵母菌株YG-4，將其用于煙末發酵，發酵液醇類、雜環類物質含量均有不同程度的增加，產生了特征香味物質，改善了發酵液香味[56]。孫偉峰利用復配酶(多糖酶、中性蛋白酶、果膠酶、淀粉酶)處理低等級煙葉，結果表明，煙葉基本成分和含量更加協調，卷煙中性香味成分含量增加[63]。王毅等利用短小芽孢桿菌Bacilluspumilus0855-9發酵制得發酵蛋白酶液，將粗酶液均勻地噴灑至低次煙葉煙絲，明顯改善了煙葉的品質、香氣質，雜氣減輕，抽吸口感較好[67]。

2.4 增香微生物與煙草浸提液

浸提液為煙草液體環境，理論上有利于微生物建立對煙草(有害物質)的耐受性，更適合增香微生物在煙葉中生長、發酵。馬海昌利用生香酵母發酵煙梗提取液獲得了增香的效果[12]。葉建斌等利用類芽孢桿菌發酵再造煙葉浸提液，提高了發酵液中香味物質種類和總量，樣品裂解過程中增加了γ-丁內酯、2,3-二氫-5-甲基呋喃、糠醛等特征煙氣致香組分[40]。駱莉利用生香酵母和植物乳桿菌發酵煙梗提取液，提升了卷煙的香氣、煙氣及口感特性[52]。

2.5 微生物降解潛香物質

在含有潛香物質的培養基中進行微生物增香發酵，目的性強，產香定向、高效。段焰青等利用米曲霉(Aspergillusoryzae) 發酵降解β-胡蘿卜素，經GC-MS檢測分析得發酵產物具有典型果香味[23]。黃申等將新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobiumpanipatense) 在含有西柏三烯-4,6-二醇培養基上進行發酵降解試驗，該菌株將西柏三烯-4,6-二醇降解為金合歡醛(8.57%)[34]。蒿洪欣等分離、篩選得到降解類胡蘿卜素的芽孢桿菌屬，生成了2-庚酮、棕櫚酸、鄰苯二甲酸酐等降解產物[80]。

綜上所述，近10年來關于煙草增香微生物的應用主要集中在賦予卷煙典型香味、開發新型煙用香料、彌補低次煙葉的香氣缺陷、提升煙草薄片品質、降解潛香物質增香等，增香微生物已成為煙葉提質增香的重要支柱，為煙草行業的發展注入新的活力。

3 結語及展望

通過總結分析，目前國內煙草生物技術的相關研究主要有以下幾部分：

1)煙草生物增香技術主要有：微生物發酵生產煙用香料，微生物發酵煙草增香，添加酶制劑或微生物+酶制劑結合發酵煙草增香。

2)煙草增香菌主要是細菌和酵母，少數為霉菌。細菌以芽孢桿菌為增香優勢菌屬，酵母菌中產香酵母、釀酒酵母為增香優勢菌屬。主要從煙草環境篩選增香微生物，篩選比例排序為：煙葉表面>煙草土壤>浸提液。

3)煙草增香技術應用主要集中在賦予卷煙特色香味、開發新型煙用香料、彌補低次煙葉的香氣缺陷、提升煙草薄片品質、降解潛香物質增香等方面。

煙草增香生物技術研究取得了一定成果，但還存在許多的問題，今后可以從以下幾方面進一步開展：

1) 煙草源高效率微生物或酶制劑的開發研究。利用現代生物技術從煙草源環境中篩選優勢增香微生物或制備酶制劑，應用于煙草發酵增香。

2)微生物增香機理探索研究，逐步挖掘出發酵增香機理、產香基因等，利用轉基因技術將增香基因導入大腸桿菌或芽孢桿菌等菌株，控制代謝途徑，定向、高效產生煙用香味物質。

3)完善煙草應用場景的工業化工藝技術，針對不同煙葉，研究菌株對煙葉生化反應的影響，優化發酵及產酶條件等，完善微生物發酵產香的工業化工藝技術，精準指導工業化生產。