雞源奇異變形桿菌的分離鑒定及生物學特性分析

閆建英，李虎，邢瀟月，劉祥杰，梁成孔，張家浩*

（1.和田地區農業農村局 新疆和田 848000；2.塔里木大學動物科學與技術學院 新疆阿拉爾 843300；3.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室 新疆阿拉爾 843300；4.新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室 新疆阿拉爾 843300）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科變形桿菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌[1]。該菌在自然界分布極廣，不僅可以在人和動物體內生存[2]，也可存在于土壤和污水等環境中。該菌可感染宿主種類多樣，能感染豬、牛和羊等常見養殖動物，也有文獻報道在水貂、狐貍和蛇等動物中分離到該菌[3]。近年來雞感染奇異變形桿菌的報道較多[4-7]，給雞養殖業帶來巨大的經濟損失。

隨著抗生素的濫用，奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強，對禽類疾病的治療與預防造成了極大的困難。賈沅錚[4]等分離的52 株奇異變形桿菌對紅霉素等5 種抗生素100%耐藥；對環丙沙星等9 種抗生素耐藥性均高于50%。徐睿[5]等分離的2 株奇異變形桿菌耐藥率分別為78.6%（11/14）和71.44%（10/14）。

本試驗無菌采集新疆阿克蘇地區某雞場病雞病料，進行病原檢測和細菌的分離培養，通過形態學觀察、生化試驗和16S rRNA序列分析進行鑒定，同時研究其耐藥性和致病性，為防控奇異變形桿菌在雞群中的傳播提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 樣品來源

2022 年7 月，新疆阿克蘇地區某雞場雛雞出現腹瀉、消瘦、擠作一團；剖檢病變主要為肝臟、脾臟等器官出現不同程度的腫大。為確定致雞群發病的病原，采集病死雞病料置于無菌自封袋中帶回實驗室診斷。

1.2 試驗動物

15 只3 日齡雛雞，購自塔里木大學動物試驗中心。

1.3 試驗方法

1）分離和純化。用高壓滅菌棉拭子蘸取肝臟內部細菌接種于BHI 固體培養基上，37℃培養12h，挑取單菌落劃線接種于SS 瓊脂固體培養基上，37℃培養12h 后，取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌形態及染色特性。

2）生化鑒定。將分離株的純培養物分別接種于細菌微量生化反應管中37℃培養24h，觀察試驗結果。

3）16S rRNA 基因的擴增。參照文獻[4]合成細菌16S rRNA 基因通用引物，預期擴增產物長度約為1,465bp。用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA 進行PCR 擴增。PCR 反應體系：模板1μL，EasyTaq SuperMix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，滅菌雙蒸水補齊至25μL。PCR 擴增程序為：94℃300s；94℃30s，56℃30s，72℃90s，72℃600s，35 個循環。將經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR 產物送至上海生工測序，對所測序列在NCBI 數據庫中進行比對，使用DNA star 對所測的菌株做進行系統發育進化樹構建及相似性分析。

4）藥物敏感性試驗。按照紙片瓊脂擴散法，對分離菌株進行藥物敏感性試驗。將17 種所測藥敏片平鋪在平板表面，37℃培養24h，測量抑菌圈直徑，判斷分離菌的耐藥性。

5）動物回歸試驗。挑取培養單個菌落在BHI 液體培養基中培養，直至濃度達到3×108cfu/mL。動物分組：將15 只3 日齡雛雞隨機分為3 組，每組5 只。第1、2 組為試驗組，第3 組為對照組。第1 組腹腔注射0.5mL 含3×108cfu/mL 的菌液，第2 組腹腔注射0.5mL 含3×107cfu/mL 的菌液，第3 組為空白對照組，不作任何處理。每日觀察、記錄試驗雛雞情況。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果

37℃培養24～48h 后，在SS 瓊脂固體培養基上生長出中心黑色，周圍白色或橘色的圓形菌落；在BHI 固體培養基上生長出表面光滑，邊緣整齊的無色透明菌落。

2.2 革蘭染色結果

菌體呈桿狀或短桿狀、革蘭染色陰性、大小均勻、兩端鈍圓、多為散在排列（見圖1）

圖1 分離菌株革蘭染色鏡檢結果圖（10×100）

2.3 生化鑒定結果

試驗結果顯示，分離菌不發酵麥芽糖、蔗糖、乳糖，甘露醇、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氧化酶試驗顯示陰性；分離菌發酵木糖、葡萄糖、覃糖，山梨醇、尿素分解、枸櫞酸鹽試驗為陽性。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8 版)[8]確定分離菌符合奇異變形桿菌的生化特性。

2.4 16S rRNA 擴增結果

將PCR 擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示擴增條帶約為1,400bp 左右，與預計大小相同。將分離菌株分別命名為X001。

2.5 16S rRNA 序列比對結果與系統發育樹的構建

由圖1 可知，分離菌株S001 與登錄號為KC456549、OL629184、OL629187、OL629213、OL629209、OL629230、ON460264、ON329112 等的奇異變形桿菌處于同一分支，將登錄號為ON000821 的枯草芽孢桿菌作為外圍支（見圖2）。

由圖2 同源性分析表可知，菌株X001 與8 株奇異變形桿菌參考株同源性均高于99.9%，與登錄號為ON000821 的枯草芽孢桿菌同源性為78.2%。結合分離菌的形態、生理生化特征和序列比對結果，將菌株X001 鑒定為奇異變形桿菌。同源性分析（見圖3）。

圖2 系統進化樹

圖3 同源性分析

2.6 藥物敏感性試驗結果

藥敏結果顯示：分離菌對復方磺胺甲噁唑表現為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現為敏感，對其他5 種抗生素表現為耐藥。試驗結果見表1。

表1 分離菌株的藥物敏感性試驗結果

2.7 動物回歸試驗

攻毒后12h，第1 組雛雞死亡2 只，試驗組其他雛雞出現臨床癥狀，表現為精神萎靡、食欲減退、縮頸閉目、畏冷、擠作一團、排白色糞便；接種24h 后，第1 組雛雞全部死亡。對死亡雛雞剖檢可見肝臟輕微腫大、表面淤血，脾臟、腎臟有不同程度的腫大。第2 組雛雞至試驗結束未發生死亡。第3 組雛雞至試驗結束較接種前無變化，各組織器官均未分離出細菌。將試驗組死亡雛雞肝臟等組織進行細菌分離培養，菌落形態、革蘭染色和生化試驗結果與原分離菌一致，16S rRNA 檢測結果也顯示分離出的細菌為奇異變形桿菌。

3 討論

在科學技術和經濟快速發展的時代下，抗生素被廣泛用于動物的感染性疾病和保健品，導致奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強，甚至出現了多重耐藥，使本病的防治十分棘手。本研究中，分離菌X001 表現多重耐藥，以往的研究中也有類似結果[4-7]。藥敏試驗表明，分離菌X001 對復方磺胺甲噁唑表現為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現為敏感，對其他幾種抗生素表現為耐藥。結合以往研究可知，國內禽源奇異變形桿菌對常用抗生素的耐藥情況較為嚴重，對藥物的敏感性越來越低，耐藥譜不斷擴大。因此臨床用藥時，一定要先做藥物敏感性試驗，根據試驗結果來選擇治療藥物。此外，在養殖過程中要對奇異變形桿菌感染引起足夠的重視，在平時的飼養中要注意加強飼養管理，提高養殖動物的免疫力，堅持防大于治的原則，在治療中要合理用藥。

雛雞回歸試驗表明該分離菌可引起雛雞精神萎靡、食欲減退并造成死亡，有較強的致病性，由于該菌是人畜共患病原菌，因此相關的蛋肉產品可能會對食品安全構成威脅。試驗雛雞癥狀和剖檢病變與雞場發病雞相同，表明奇異變形桿菌是該雞場雛雞發病、死亡的致病菌。在本病例中，筆者根據藥敏試驗結果使用慶大霉素進行治療，用藥后雞場病雞臨床癥狀消失，死亡率下降。

我國社會經濟的快速發展雖然推動著家禽養殖行業的向前邁進，但因為巨大的市場競爭力和飼養周期的縮短使雞群的免疫力逐漸地降低，尤其是雛雞的奇異變形桿感染率增加，這對于食用性動物源產品是一種潛在的巨大的危害。因此，需要對該地區雞場提供可行性的建議，首先要合理規范的使用抗菌藥，以降低耐藥性、減少多重耐藥菌株的出現。與此同時，需要提高動物的飼養技術和管理模式，對圈舍以及養殖環境制定一個合理規范的清潔消毒計劃，堅持自繁自養，全進全出，防患于未然。

4 結論

本試驗從新疆阿克蘇地區某雞場病雞體內分離到1 株細菌，經細菌分離培養、形態學觀察、生化鑒定和16S rRNA 序列鑒定，確定分離菌為奇異變形桿菌。確診引起該雞場雛雞發病、死亡數量增加的病因為奇異變形桿菌感染，表明新疆阿克蘇地區雞群中存在奇異變形桿菌感染，應進一步改善雞場飼養管理模式并加強禽類食品的安全衛生檢測工作。藥敏試驗表明分離菌具有多重耐藥性，應加強對奇異變形桿菌耐藥性的檢測。本研究為該病的防治和臨床合理用藥提供了科學依據。■