狗蟻草總生物堿對大鼠肝星狀細胞膠原蛋白、細胞因子的影響

唐云麗, 鄭作文, 甘彩玉, 梁冰潔, 韋建華, 張文濤, 彭 成

（1.成都中醫藥大學西南特色中藥資源國家重點實驗室, 成都 611137；2.廣西中醫藥大學藥學院, 南寧 530200）

據WHO 統計, 2017 年全球肝纖維化患者占肝臟疾病患者的60.72%[1, 2］。肝纖維化主要是由肝臟內纖維結締組織異常增生所致的[3, 4］, 它不僅會破壞肝組織結構, 還會影響肝細胞的血液供應。雖然肝纖維化是疾病發展過程中可逆性的病理進程, 但是進一步可發展為肝硬化、肝癌, 嚴重者造成肝衰竭甚至危及生命[5, 6］。因此, 迫切需要研究出高效的防治方案阻止肝纖維化的發生發展。

狗蟻草為廣西壯族自治區民間常用壯藥之一, 為豆科植物鏈莢豆（Alysicarpus VaginalisL. DC.）的全草, 又名大葉青、山土豆、山花生等, 主要分布在廣西、福建、廣東等地, 在廣西壯族自治區資源非常豐富[7］。其性涼, 味甘、苦, 具活血通絡、清熱化濕、接骨消腫、去腐生肌的功效[7］。其單味藥與豬肉燉服可用來治療慢性肝炎[7］。研究發現狗蟻草乙酸乙酯提取物對四氯化碳致肝纖維化小鼠有明顯的干預作用[8］, 證明狗蟻草對肝纖維化治療有顯著活性成分, 且從狗蟻草乙酸乙酯提取物分離的總生物堿可抑制T6 細胞的增殖[8-11］, 對肝星狀細胞有抑制作用, 但其作用機制尚未深入研究。已有研究發現從其他中草藥提取的生物堿可通過降低T6細胞分泌的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ膠原含量及細胞因子TGF-β1、PDGF 含量而抑制T6 細胞的增殖作用[12］。

本研究以狗蟻草總生物堿（AVTA）為研究對象, 驗證其在體外對HSC-T6 細胞藥物活性的基礎上, 研究AVTA 對HSC-T6 細胞分泌物Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及促肝纖維化因子PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量的影響, 進而探討AVTA 抗肝纖維化作用與細胞因子之間的關系, 對開發中草藥狗蟻草具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 狗蟻草全草采自廣西壯族自治區武鳴縣, 經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為豆科鏈莢豆（Alysicarpus VaginalisL.DC.）的全草。

1.1.2 試劑 HSC-T6 細胞株由廣西中醫藥大學藥理教研室提供；DMEM 培養基、胰蛋白酶、PBS 溶液、0.4%臺盼藍染液、二甲基亞砜（DMSO）、四氮唑藍MTT、秋水仙堿（Solarbio 公司）；新生牛血清（Hy-Clone 公司）；Rat ColⅠELISA Kit、Rat Col ⅢELISA Kit、Rat PDGF ELISA Kit、Rat TNF-α ELISA Kit、Rat IGF-1 ELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit（R&D 公司）。

1.1.3 儀器 DLE560 超凈工作臺（荷蘭Clean Air公司）；二氧化碳培養箱（美國Shel-lab 公司）；DMIRB 倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；酶標儀（美國BIO-TEK 公司）；離心機（德國Biofuge Stoctos 公司）。

1.2 方法

1.2.1 AVTA 的提取與鑒定

1）提取。取狗蟻草粗粉用75%乙醇溶液回流提取3 次, 每次回流1.5 h, 過濾, 收集醇提液, 回收乙醇至無醇味稠膏狀。用0.5%硫酸溶液溶解稠膏, 過濾, pH 調至9～10, 于4 ℃下靜置5 d, 再用等量乙酸乙酯萃取, 收集乙酸乙酯層, 重復3 次, 回收乙酸乙酯濃縮至稠膏狀, 得膏體, 即得AVTA。

2）鑒定。①沉淀反應：取適量膏體, 用0.5%硫酸溶液溶解, 分成3 份, 分別滴加適量的碘化鉍鉀溶液、碘化汞鉀溶液和苦味酸溶液, 觀察現象。②TLC定性：取適量膏體, 用乙酸乙酯溶解, 于硅膠G 板點樣, 展開系統（氯仿:甲醇=3:1）展開, 用碘蒸氣和改良碘化鉍鉀顯色, 觀察現象。

1.2.2 AVTA 對HSC-T6 細胞增殖的影響 取對數生長期的細胞, 0.25%胰酶消化后離心收集, 采用完全培養液重懸細胞, 在96 孔板中接種, 每孔體積100 μL, 分為9 個組, 分別為細胞對照組和8 個不同濃度AVTA 組（濃度為52.70、37.65、26.89、19.29、13.72、9.80、7.00、5.00 μg/mL）, 每組5 個重復孔[13］。細胞接種后, 孵育24 h 后棄去原液, 細胞對照組加入DMEM 完全培養液, 各給藥組加入相應濃度的藥液, 每孔100 μL, 繼續培養48 h 后, 于570 nm 處測定OD值。計算細胞生長抑制率, 根據抑制率求出IC50, 根據抑制率選取3 個對細胞無毒濃度繼續進行后續試驗。抑制率=（1-給藥組OD值/對照組OD值）×100%；IC50由SPSS21.0 統計軟件計算。

1.2.3 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的細胞因子含量的影響 設3 個濃度的AVTA 組（濃度分別為10.00、7.00、4.90 μg/mL）, 并設細胞對照組、秋水仙堿組（終濃度6.25 μg/mL）, 每組5 個復孔, 接種后在培養箱中于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h 后, 棄去原培養液, 細胞對照組加入DMEM 完全培養液, 各給藥組加入相應濃度的藥液, 繼續培養48 h 后, 收集細胞上清液于3 000 r/min 離心20 min, 取上清液, 按ELISA試劑盒說明書檢測COLⅠ、COLⅢ、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件分析計量資料, 數據以均數±標準差（±s）表示, 組間比較用t檢驗（方差不齊時采用t檢驗校正公式）, 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 AVTA 對HSC-T6 細胞活性影響

如表1所示, AVTA 作用于HSC-T6細胞48 h后,IC50為44.17 μg/mL, 無毒濃度在13.72 μg/mL以下。

表1 AVTA 對HSC-T6 細胞無毒濃度測試（±s, n=5）

表1 AVTA 對HSC-T6 細胞無毒濃度測試（±s, n=5）

注：與對照組比較, “*” 表示差異顯著（P＜0.05）, “**” 表示差異極顯著（P＜0.01）

濃度//μg/mL 0（對照組）52.70 37.65 26.89 19.29 13.72 9.80 7.00 5.00 OD 值0.89±0.02 0.41±0.15**0.44±0.06**0.64±0.14**0.79±0.09*0.80±0.06 0.82±0.04 0.83±0.06 0.84±0.05抑制率//%54.35 50.30 28.52 11.33 10.50 8.32 6.31 5.56 IC50//μg/mL 44.17

2.2 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的COLⅠ、COLⅢ、PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 含量的影響

由圖1 至圖6 可以看出, 當AVTA 終濃度為10.00 μg/mL 時, 與細胞對照組相比能顯著抑制HSC-T6 細 胞 分 泌 的COL Ⅰ、COL Ⅲ膠 原 蛋 白 和PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細胞因子（P＜0.01 或P＜0.05）, 當AVTA 終濃度為7.00 μg/mL 時, 與細胞對照組相比, 能顯著抑制HSC-T6 細胞分泌的COLⅠ、COLⅢ膠原蛋白和TNF-α、IL-6 細胞因子（P＜0.01 或P＜0.05）。

圖1 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的COLⅠ含量的影響（±s）

圖2 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的COLⅢ含量的影響（±s）

圖3 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的PDGF 含量的影響（±s）

圖4 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的TNF-a 含量的影響（±s）

圖5 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的IGF-1 含量的影響（±s）

圖6 AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的IL-6 含量的影響（±s）

3 小結與討論

肝纖維化是在炎癥刺激下肝臟細胞（如HSC等）異常活化而導致細胞外基質（ECM）合成過多, 積累沉積而引起[14-21］。治療肝纖維化的關鍵途徑是抑制肝星狀細胞（HSC）活化, 降解其合成的肝內膠原如Ⅰ型、Ⅲ型膠原等[22］。為此, 本試驗預先驗證了AVTA 對HSC-T6 細胞增殖的影響, 明確了AVTA 抗肝纖維化的無毒濃度。已證實肝纖維化的發生與發展與細胞因子PDGF（血小板衍生生長因子）、IGF-1、TNF-α、IL-6 等有著密切關系, 共同作用可促進疾病進展, 是評估肝纖維化風險的指標。其中大量分泌的PDGF、IGF 等細胞因子刺激HSC 異常活化, 異常活化HSC 反過來又能過量分泌PDGF 因子, 進而合成分泌TGF-β1、TNF-α 等細胞因子, 促進活化的HSC 轉化為肌成纖維細胞, 從而使肝竇血流抑制和肝小葉結構紊亂, 造成肝纖維化病態[23-25］。

肝星狀細胞可分泌炎癥因子TNF-α, 可介導NF-кB 信號傳導通路, 誘發或加重肝臟炎癥, 加快肝纖維化的發生, 如昆明山海棠總生物堿就是通過抑制介質TNF-α 及NO 的生成來發揮其抗炎作用[26］。另外, 肝纖維化進一步的進展可能誘發肝臟癌變。研究發現, TNF-α 可通過調節ROS/HIF-1α信號通路促進肝癌細胞生長[27］, IL-6 可通過刺激炎性反應, 通過影響TIMPs-mRNA、α-SMA、MMPsmRNA 表達, 是ECM 滯留并沉積的關鍵因素, 而引起ECM 沉積導致肝纖維化的出現受多種細胞因子及細胞內信號轉導系統調節肝星狀細胞的活化是肝纖維化過程中的重要事件, 藥物通過阻止PI3K/Akt信號通路活化而抑制PDGF 誘導的人肝星狀細胞活化, 進而減少TNF-α、IL-6 的分泌, 提高抗肝纖維化的療效, 如姜黃素可通過多種機制參與預防肝纖維化的過程[28］。因此, 通過抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細胞因子的分泌能有效減輕甚至逆轉肝纖維化。

本研究預先選取HSC-T6 細胞進行體外藥效試驗, 證明AVTA對HSC-T6細胞增殖的無毒濃度[29-30］, 明確AVTA 可能為治療肝纖維化的有效成分, 并進一步研究AVTA 抗肝纖維化可能的作用機制[31］。與細胞對照組相比較, AVTA 對HSC-T6 細胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6 細胞因子有明顯的抑制作用, 也能顯著降低HSC-T6 細胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原及PDGF、TNF-α、IGF-1、IL-6細胞因子的含量, 且抑制程度呈劑量依賴關系。AVTA 抗肝纖維化的作用機制與細胞因子的表達有一定相關性, 具體機制有待進一步探索研究, 為深入探討狗蟻草治療肝臟疾病奠定了理論基礎, 為中草藥狗蟻草的開發提供科學意義。