大黃魚油提取工藝優化及品質分析

趙騰飛, 賀 蘇, 王道飛, 李晚成, 應曉國, 馬路凱, 鄧尚貴

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院, 浙江 舟山 316022；2.湖北省十堰市農產品質量檢驗檢測所, 湖北 十堰 442000；3.仲愷農業工程學院輕工食品學院, 廣州 510225；4.廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室, 廣州 510145）

魚油含有豐富ω-3 不飽和脂肪酸[1, 2］, 尤其二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量較高。魚油主要成分EPA、DHA、膽固醇以及甘油三脂能夠控制人體血脂濃度, 提高人體高密度脂蛋白含量[3-6］, 預防心血管疾病及改善內分泌功能等[7-9］。二十碳五烯酸（EPA）被稱為 “血管清道夫” , 它還具有疏導清理心臟血管、血栓的功能[10, 11］。魚油中富含磷脂[12］、維生素等成分易被皮膚表層吸收, 增強皮膚光澤度, 緩解皮膚干燥, 抵抗微生物侵入[13, 14］。

劉汝萃等[15］研究發現, 魚油能減少動脈硬化, 針對人體痛風、風濕性關節炎有緩解作用, 促進嬰兒視網膜發育。付雪媛等[16］研究章魚油中脂肪酸組成, 分析多種不飽和脂肪酸對人體健康的影響。目前, 消費者在加工魚肉過程中, 舍去油脂較多部位, 但根據相關研究表明, 魚油含豐富營養物質, 具有多種生理功能[17］。近年來, 隨著居民生活水平不斷提高, 人們對營養保健產品關注度日漸提升, 魚油保健品便是其中之一, 另外魚油成分還包括必需脂肪酸, 如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸。魚油可以調節血脂, 改善視力, 維護視網膜功能[18］。張建等[19］利用祛除魚鱗的方法增強皮膚恢復功能, 并觀察皮膚吸收能力, 進而促進皮膚吸收、排泄及代謝功效。衛文[20］發現魚油能改善皮膚炎癥, 通過補充膳食魚油降低大氣顆粒物暴露導致皮膚炎癥反應和氧化應激損失。劉海英[21］經過新一項臨床試驗數據表明當人體長期服用一定劑量omega-3 脂肪酸, 能夠預防皮膚癌, 增強皮膚免疫力, 減輕陽光照射引起的免疫抑制作用, 因為omega-3 脂肪酸是一種能夠防止皮膚癌的重要營養成分。

本研究以大黃魚為原料, 研究不同有機溶劑提取大黃魚油的差異, 分析得出最佳提取方法, 通過影響因素工藝條件的控制做進一步優化, 提高魚油提取率, 并分析魚油理化品質、細胞毒性、皮膚吸收性等指標, 為大黃魚油資源開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：大黃魚, 購自浙江舟山新城大洋世家漁業有限公司, 大黃魚置于裝有冰塊超低溫箱, 0.5 h 內運回實驗室, -18 ℃儲藏。

試劑：石油醚、正己烷、乙醇（分析純, 國藥集團化學試劑有限公司）；氮氣（浙江舟山鴨蛋山先鋒氣體有限公司）。

1.2 儀器與設備

MDF-U53V 型冰箱, 日本Sanyo 公司；CF-16RN型高速冷凍多用途離心機, 日本日立公司；FJ200-S型數顯高速均質機, 湖南力辰儀器科技有限公司；AR224-CN 型電子天平, 奧豪斯儀器上海有限公司；Soxtec FOSS 型脂肪提取器, 福斯分析有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發儀, 上海亞榮生化儀器廠；HC-0520 型循環泵, 杭州惠創儀器設備有限公司；Vortex QL-861 型漩渦振蕩器, 海門市其林貝爾儀器有限公司；HHS-21-4 型電熱恒溫水浴鍋, 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DSC-200F3 型差示掃描量熱儀, 德國耐馳儀器公司；SM800 型酶標儀, 上海永創醫療器械有限公司；CM-5 型色度計, 日本柯尼卡美能達。

1.3 試驗方法

1.3.1 大黃魚魚油提取工藝流程

新鮮大黃魚→去除內臟→取腹部魚肉→磁力攪拌→魚糜量取→索氏抽提→旋蒸純化→收集

1.3.2 單因素試驗 根據初步試驗的分析和資料查閱[22］, 以大黃魚油提取率為結果, 其他操作條件保持一致, 研究提取溫度、提取時間、溶劑體積3 個因素變量對魚油提取率的影響。

1）提取溫度對魚油提取率的影響。以提取時間120 min, 溶劑體積40 mL 條件下, 分別設置溫度60、70、80、90、100 ℃, 探究不同提取溫度對魚油提取率的影響, 確定最佳提取溫度。

2）提取時間對魚油提取率的影響。以提取溫度70 ℃, 溶劑體積40 mL 條件下, 分別設置時間100、110、120、130、140 min, 探究不同提取時間對魚油提取率的影響, 確定最佳提取時間。

3）溶劑體積對魚油提取率的影響。以提取溫度70 ℃, 時間120 min 條件下, 分別設置溶劑體積30、35、40、45、50 mL, 探究不同溶劑體積對魚油提取率的影響, 確定最佳溶劑體積。

1.3.3 響應面試驗設計 在單因素試驗結果基礎上, 采用Box-Behnken 8.0 響應面模型[23, 24］, 設定魚油提取率為響應值, 分別用A、B、C表示提取溫度變化量、時間變化量、溶劑體積添加量3 個自變量, 每個變量低、中、高水平以-1、0、1 編碼, 中心組合設計的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 8.0 設計水平因素

1.3.4 指標測定

1）大黃魚油提取。參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》, 稱取8.00 g 魚肉研磨置于濾紙, 索氏抽提法提取油脂[25］。

2）大黃魚油脂肪酸測定。脂肪酸甲酯化及測定方法參考前期研究[26］。

3）大黃魚油理化指標測定。酸價、過氧化值、茴香胺值分別參照GB 5009.228—2016、GB 5009.227—2016 和GB/T 24304—2009 測定；共軛二烯值測定參考文獻[26］并略作修改, 稱取油樣0.010～0.020 g于小燒杯中, 5 mL 異辛烷溶解, 定容至50 mL, 波長232 nm 測其吸光度, 以異辛烷為調零組測定。

4）大黃魚油角鯊烯含量測定。角鯊烯含量參考T/ZNZ 027—2020 氣相色譜-串聯質譜法測定。

5）大黃魚油生育酚測定。參照方冰等[27］方法略作修改：稱取0.5 g 油樣于具塞試管, 加入0.125%抗壞血酸和5 mL 2 mol/L 氫氧化鉀-乙醇溶液, 60 ℃皂化反應1 h, 待反應液冷卻后, 加入5 mL 正己烷, 重復提取3 次后合并提取液, 有機相旋轉蒸干, 甲醇定容10 mL, 經0.45 μm 微孔濾膜過濾, 濾液備用。

高效液相色譜條件：采用C18 色譜柱（5 μm, 4.6 mm×250 mm）, 填充平均粒徑約為5 μm 二醇基硅膠柱, 柱溫30 ℃, 甲醇為洗脫劑, 流速1 mL/min, 檢測波長294 nm。

6）大黃魚油甾醇測定。大黃魚油中甾醇測定采用氣相色譜-串聯質譜聯用儀, 具體方法[28］：精確稱取5 mg 油樣于具塞試管, 加入2 mg 5-α-膽甾烷-3-β 醇（膽甾烷醇）為內標, 加入2 mol/L 氫氧化鉀-乙醇溶液2 mL, 搖勻超聲5 min, 70 ℃皂化1 h, 皂化液冷卻后, 加入4 mL 水和6 mL 正己烷, 漩渦振蕩, 靜置分層, 收集上清液。下層相5 mL 正己烷再次萃取, 合并有機層, 氮氣吹干, 加400 μL 硅烷化試劑BSTFA:TMCS（99:1）, 70 ℃反應30 min, 1 mL 正己烷溶解, 取1 μL 上GC-MS 進樣。

GC-MS 色譜條件：色譜柱TG-SQC（0.25 μm, 30 m×0.25 mm）, 載氣為氫氣, 流速36 cm/s, 分流比1:20, 電離方式EI, 電子能量70 eV, 離子源溫度200 ℃, 檢測器溫度及進樣口溫度320 ℃, 柱溫用程序升溫方式, 以4 ℃/min 速度從240 ℃增加至255 ℃, 進樣量1 μL。

7）大黃魚油色差測定。參照朱建龍等[29］方法略有修改：色度計測定大黃魚油顏色, 魚油色差值以L*[黑（0）至白（100）］、a*[綠（-）至紅（+）］、b*[藍（-）至黃（+）］的顏色參數。

8）大黃魚油熱變性溫度測定。DSC-200F3 型差示掃描量熱儀測定大黃魚油熱變性溫度, 準確稱取10 mg 大黃魚油放入坩堝中, 以空坩堝作為參比。樣品經過設置參數, 起始溫度20 ℃, 升溫速率20 ℃/s, 終止溫度210 ℃, DSC 配套軟件分析大黃魚油吸熱峰所對應峰值溫度。

9）大黃魚油CSCP 細胞毒性試驗。參照陳銳等[30］方法略作修改：使用CCK-8 試劑盒檢測0.00%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%不同質量濃度魚油細胞的存活率, 37 ℃培養4 h, 450 nm 波長處測定其OD。按下列公式進行：

式中,OD1為藥物組OD值；OD2為空白對照組OD值；OD3為空白孔OD值。

10）大黃魚油皮膚吸收值測定。測定大黃魚油皮膚吸收值參考艾麗奇[31］方法略加修改。

1.3.5 數據處理 所有試驗均平行測定3 次, 采用Origin 軟件作圖, 得到數據以 “平均值±標準差” 表示, SPSS 24.0 軟件Duncan 分析數據, 多重比較得差異顯著性分析結果（P＜0.05）, Design-Expert 8.0.6 軟件分析響應面。

2 結果與分析

2.1 有機溶劑對大黃魚油提取率的影響

4 種有機溶劑為提取劑, 按照提取溫度70 ℃, 時間120 min, 有機溶劑體積40 mL 進行大黃魚油提取, 結果如圖1 所示。由圖1 可知, 石油醚與正己烷+乙醇的混合液（3:1,v/v）提取魚油率相當, 石油醚提取率為（31.26±1.04）%, 正己烷+乙醇（3:1,v/v）提取率為（31.27±1.09）%, 均無顯著性差異（P＞0.05）。根據自動索氏抽提國標法, 選取石油醚提取魚油具有便捷、快速、環保等優點。石油醚提取魚油率為（31.26±1.04）%, 得到清澈且呈深黃色外觀、強烈油脂氣味, 并略帶面包香味的魚油。其次提取魚油效果依次為正己烷提取率（25.27±1.09）%, 乙醇提取率（22.43±1.13）%, 乙醇得油率為4 種有機溶劑最低。有機溶劑提取率差異性可能源于各自相似相容原理[32］。因此從魚油感官品質、色澤、風味綜合考慮, 本試驗按照國標法——石油醚的方法優化提取魚油。

圖1 有機溶劑對大黃魚油提取率的影響

2.2 提取溫度對魚油提取率的影響

由圖2 可知, 在70 ℃時魚油提取率最高（30.10±0.94）%, 隨著溫度升高提油率顯著降低, 當提取溫度為100 ℃時, 魚油提取率與70 ℃相比相差（4.64±0.32）%, 可能是油脂在高溫會發生脂質氧化[33］, 產生其他小分子醛酮等雜質成分, 從而降低了魚油提取率。因此綜合考慮, 選取適宜提取溫度為70 ℃。

圖2 不同提取溫度對魚油提取率的影響

2.3 提取時間對魚油提取率的影響

由圖3 可知, 100～120 min 時魚油提取率恒速上升, 這可能是由于在自動索氏抽提試驗中, 隨著提取時間延長, 魚油分解速度較大且提油率提高。提取時間為120 min 時, 魚油提取率達到最高（30.43±0.11）%, 顯著高于提取時間130 min 時的魚油提取率（P＜0.05）?？赡苁且驗樘崛r間過長, 油脂發生氧化產生其他雜質成分導致魚油量下降[34-36］。因此綜合考慮, 選最佳提取時間120 min。

圖3 不同提取時間對魚油提取率的影響

2.4 溶劑體積對魚油提取率的影響

由圖4 可知, 溶劑體積30～40 mL 時, 魚油提取率隨溶劑體積增加而增加, 體積40 mL 時魚油提取率最高為（30.79±0.37）%, 溶劑體積越大, 魚油提取率越低, 這主要是因為魚油浸出速率減緩, 提取成分減少, 導致魚油提取率下降。因此, 選取適宜溶劑體積40 mL 做下一步試驗條件要求。

圖4 不同溶劑體積對魚油提取率的影響

2.5 響應面試驗結果分析

試驗結果通過軟件分析, 選取A（提取溫度）、B（提取時間）、C（溶劑體積）3個因素, 試驗結果見表2。

表2 響應面分析試驗方案

用軟件對上表中的數據進行分析, 方程為：

式中,Y為提取率,A、B、C分別為提取溫度變化量、提取時間變化量、溶劑體積添加量。

提取率響應面方差分析結果如表3, 模型的P＜0.01, 說明該模型是極顯著的。失擬項P=0.252 0＞0.05, 說明失擬項與純誤差之間的差異不顯著, 可以應用該式。A、B、C、AC、A2、B2、C2影響均顯著（P＜0.01）,AB、BC影響不顯著（P＞0.05）。根據F大小, 得出3 個因素提取效果排序為：溶劑體積（C）＞提取時間（B）＞提取溫度（A）。

表3 提取率響應面方差分析結果

2.6 回歸模型的建立及分析

由響應面方差分析結果可知, 三個因素之間, 提取溫度變化量和溶劑體積變化量對魚油提取率交互作用較顯著, 可視化分析如圖5響應面及等高線所示。

由圖5 可以得出, 曲線變化顯著, 說明提取溫度變化量和溶劑體積添加量對魚油提取率影響大。等高線圖呈橢圓形, 其提取率隨著提取溫度變化量和溶劑體積增加量而增大, 出現先增加后減少趨勢, 因而存在極值, 且AC兩因素的交互作用P=0.001 9, 顯著性極強。由表3 可知,A因素的F值比C因素的F值小, 推斷出提取溫度變化量對魚油提取率影響程度小于溶劑體積對提取率的影響程度, 與圖5 形狀符合。

圖5 提取溫度和溶劑體積對大黃魚魚油提取率的響應面及等高線

2.7 驗證試驗

采用響應面分析優化功能軟件, 預測出魚油提取率配額比例為：提取溫度69.48 ℃, 提取時間121.26 min, 溶劑體積39.44 mL。此時, 得出魚油提取率為（35.21±0.18）%。

為驗證此配額可靠性, 設計優化試驗, 將配方修改為提取溫度70 ℃, 提取時間121 min, 溶劑體積40 mL。在優化條件下進行3 次平行試驗, 如表4所示。

表4 最佳工藝驗證結果

由表4 可知, 在最優工藝下得出的平均值為（35.18±0.88）%, 與響應面法軟件算出最佳提取率值（35.21±0.18）%相近, 從而進一步證實了試驗結果的可靠性。此時, 按照優化后配比進行試驗, 得出魚油色澤亮麗、富有濃厚油樣香氣味, 魚油外觀見圖6。

圖6 大黃魚油

2.8 大黃魚油基本理化、脂溶性指標檢測結果

由表5 可知, 大黃魚油酸價為（0.53±0.02）mg/g, 與姚仕彬等[37］測定魚油0 d 酸價值（0.51±0.04）mg/g接近, 符合GB 5009.229—2016 酸價檢測范圍。大黃魚油過氧化值（3.06±0.27）g/100 g 符合優質魚油評判標準[38］, 它是衡量氫過氧化物的氧化產物[39］, 本試驗過氧化值測定反映了魚油氧化初期狀態。大黃魚油茴香胺值新鮮指標0.29±0.04, 測定茴香胺值含量主要利用2, 4-二烯醛量化油的二次氧化產物, 確定每種已經分解的氧化物質含量。大黃魚油共軛二烯值21.84±0.34, 其反映魚油所含共軛二烯數量以及判斷魚油氧化程度、分解物多少[40］。大黃魚油中含有少量生育酚4.23 mg/100 g, 以α-生育酚為主, 其次β-生育酚為0.11 mg/100 g、γ-生育酚0.13 mg/100 g、δ-生育酚0.21 mg/100 g。大黃魚油膽固醇含量367.58 mg/100 g, 有報道膽固醇過多會增加動脈粥樣硬化等一系列疾病[41］, 而降低大黃魚油膽固醇含量方法仍需進一步研究。此外大黃魚油中還有角鯊烯含量37.53 mg/100 g, 角鯊烯在人體內可供給氧氣, 凈化血液, 改善酸性體質, 大黃魚油中含有角鯊烯可以為人體健康發揮一定作用。

表5 大黃魚油理化、脂溶性指標測定結果

2.9 大黃魚油脂肪酸組成及含量檢測結果

由表6 可知, 采用氣相色譜-串聯質譜聯用儀檢測魚油脂肪酸含量, 大黃魚油包含單不飽和脂肪酸3 種、多不飽和脂肪酸6 種、飽和脂肪酸5 種, 幾種不同脂肪酸含量各不同, 其中單不飽和脂肪酸中油酸含量最高（31.04±0.12）%, 多不飽和脂肪酸中EPA（4.49±0.03）%, DHA（7.20±0.09）%, 必需脂肪酸亞油酸（12.20±0.04）%。劉迪[42］探究不同儲存方法對魚油氧化影響, 分析表明油酸性質穩定, 變化不顯著。本試驗大黃魚油中油酸含量高, 說明大黃魚油性質比較穩定。多不飽和脂肪酸（32.74±0.23）%, 對人體有降低膽固醇功效。魏岱岳等[43］分析了PUFA 對人體的作用, 它可以使人體膽固醇酯化, 降低血中膽固醇和甘油三酯, 提高腦細胞的活性及增強記憶力和思維能力。

表6 大黃魚油脂肪酸組成

2.10 大黃魚油色差結果

大黃魚油新鮮期魚油色差值如表7 所示。大黃魚在新鮮期的L*為78.67±0.19,a*為-0.29±0.02,b*為1.98±0.04, 色差鮮艷, 蛋白成分充足, 在新鮮期最大程度上保留魚油色差。

表7 大黃魚油色差值

2.11 大黃魚油熱變性溫度測定結果

大黃魚油變性曲線如圖7 所示, 魚油在40～160 ℃時, 放熱含量均不同, 而魚油在121.60 ℃, 出現最高峰值, 此時魚油變性溫度釋放熱量最高2.50 mW/mg。

圖7 大黃魚油熱變性溫度

2.12 不同魚油濃度對Caco-2 細胞存活率的影響

表8 試驗數據表明, 隨魚油濃度增加, Caco-2 細胞存活率逐漸降低。添加濃度不高于0.30 mg/mL時, Caco-2 細胞的存活率＞90%, 魚油添加濃度為0.40 mg/mL 時, 細胞存活率降低至（88.43±0.43）%, 出現明顯下降趨勢。因此魚油濃度過高會影響細胞的存活率, 產生腐敗菌[44］。

表8 不同魚油濃度對Caco-2 細胞存活率的影響

2.13 大黃魚油對皮膚吸收值的影響效果

魚油富含對人體有益的不飽和脂肪酸、磷脂、維生素等成分, 容易被皮膚表層吸收, 增強皮膚光澤度, 緩解皮膚干燥, 抵抗微生物的侵入。根據表9 皮膚吸收值來判斷魚油對人體皮膚的吸收程度, 結果表明, 魚油敷在皮膚上可以增強皮膚抵抗能力。鑒于吸收值隨魚油濃度增加先上開后有所下降趨勢, 綜合考慮使用魚油在有效濃度范圍內對人體皮膚是有益的。

表9 大黃魚油對皮膚吸收值的影響

3 結論

通過單因素試驗獲得初步最佳溶劑提取方式, 即當提取溫度70 ℃, 提取時間121 min, 溶劑體積40 mL 條件下提取率最高, 這3 個單因素對大黃魚油提取率影響依次為溶劑體積＞提取時間＞提取溫度, 此時, 所測魚油酸價、過氧化值、茴香胺值、共軛二烯值均在國標限量范圍內。α-生育酚含量為4.23 mg/100 g, β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚含量較少。角鯊烯含量為37.53 mg/100 g, 甾醇中膽固醇含量為367.58 mg/100 g, 富含豐富的必需脂肪酸, 必需脂肪酸亞油酸含量（12.20±0.04）%, 魚油熱變性溫度121.60 ℃, 對皮膚無毒, 且可以促進皮膚的吸收能力, 增強皮膚光澤度, 緩解皮膚干燥。本試驗通過優化大黃魚油提取條件, 分析大黃魚油理化品質, 目的是為大黃魚精加工及開發高品質油脂奠定一定的理論基礎。