乙醇冷凝回流與超聲波輔助提取葛根藥材總黃酮

曾建光, 徐雨生, 徐 翔, 余正勇, 金晨鐘

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 湖南 婁底 417000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院, 云南 文山 663000）

葛根（Pueraria edulis）又名葛藤、葛麻葉、粉葛藤等, 為豆科植物野葛或甘葛藤蘿的塊根, 其味甘、辛, 性平, 用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中[1, 2］。葛根是一種藥食同源類(lèi)植物, 歷來(lái)有 “千年人參” 之美稱(chēng)[3］, 具有很高的食用及藥用價(jià)值。藥理學(xué)研究表明, 葛根具有美容養(yǎng)顏、平穩(wěn)血糖血壓、保護(hù)心臟、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[4］。葛根的藥用功能始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》, 《名醫(yī)別錄》記載葛根粉可直接吞服或泡服, 還可以熬湯食用, 可用于治療傷寒、中風(fēng)、頭痛解肌發(fā)表出汗, 開(kāi)腠理, 療金瘡, 止痛和脅風(fēng)痛叫, 其品質(zhì)直接關(guān)系到公眾藥食的安全性及有效性[5, 6］。

目前, 工業(yè)中藥生產(chǎn)和檢測(cè)中常用的傳統(tǒng)提取工藝（索式提取和回流提取等方法）, 具有提取時(shí)間長(zhǎng), 影響提出率, 且有的藥材還因加熱時(shí)間長(zhǎng), 某些有效成分受到破壞等[7, 8］。為克服傳統(tǒng)方法的不足之處, 尋找對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的提取方法, 利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù), 努力開(kāi)發(fā)祖國(guó)的植物資源[9］。

本研究通過(guò)乙醇冷凝回流和超聲波輔助2 種提取法, 對(duì)比分析了3 個(gè)不同產(chǎn)地葛根樣品的總黃酮含量, 為后期葛根的規(guī)范化種植及其合理開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù), 為葛根總黃酮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S2s 型恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng)）；BSA224S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。蘆丁（濃度≥98%, 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司, 生化試劑）；95%的乙醇溶液、無(wú)水乙醇溶液（湖北興東城化工有限公司, 分析純）；亞硝酸鈉（NaNO2）（夏縣運(yùn)力化工有限公司, 分析純）；硝酸鋁[Al（NO3）3］（濟(jì)南坤豐化工有限公司, 分析純）；氫氧化鈉（NaOH）（滄州彰化工產(chǎn)品有限公司, 分析純）。

1.2 樣品處理

以產(chǎn)自云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)的野生葛根作為檢測(cè)樣本, 樣品編號(hào)見(jiàn)表1。樣本沖洗干凈后帶回, 再經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次, 置于預(yù)凍（-40.5 ℃）2 h、低溫（-15 ℃）保持5 h、干燥（35 ℃）16.5 h、升華（15 ℃）8 h 的凍干機(jī)凍干。將凍干完全的葛根用粉粹機(jī)進(jìn)行粉碎, 過(guò)3 號(hào)篩后裝入不同編號(hào)的廣口瓶中備用。

表1 樣品來(lái)源

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品2 mg, 緩慢加入80%乙醇溶液溶解, 定容至50 mL 的具塞容量瓶中, 搖勻, 制備1 mL 含40 μg的對(duì)照品溶液。

1.4 波長(zhǎng)的選擇

用5 mL 的移液管吸取蘆丁對(duì)照品溶液5 mL 轉(zhuǎn)移至25 mL 具塞比色管中, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液加入比色管中, 搖勻, 靜置6 min, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液加入其中, 搖勻, 靜置6 min, 加入4.0 mL 4%的氫氧化鈉溶液, 最后用80%乙醇溶液定容至10 mL, 塞上塞子將其混勻, 靜置15 min。以不加蘆丁對(duì)照品溶液的混合液為空白對(duì)照, 在波長(zhǎng)為200～900 nm 的范圍內(nèi)掃描, 確定了最大吸收波長(zhǎng)為476 nm[10］。

1.5 乙醇冷凝回流提取法提取

精密稱(chēng)取葛根干燥粉3 g 置于經(jīng)過(guò)干熱滅菌的具塞錐形瓶中, 用25 mL 的移液管精密加入80%乙醇溶液50 mL, 稱(chēng)定其樣品錐形瓶溶劑的總重量, 分別用恒溫水浴鍋冷凝回流30、20、10 min, 放冷, 稱(chēng)重, 補(bǔ)足失重過(guò)濾后待用。

取1 mL 濾液到50 mL 具塞容量瓶中, 最后用80%乙醇溶液定容到刻度處, 蓋上塞子搖勻。取5 mL供試品溶液至10 mL 具塞比色管中, 紫外分光光度計(jì)依次測(cè)定吸光度。

1.6 超聲提取法提取

精密稱(chēng)取葛根干燥粉3 g 置于具塞錐形瓶中, 用移液管精密加入濃度為80%乙醇溶液50 mL, 稱(chēng)定其重量, 分別用超聲波清洗器超聲10、20、30 min, 放冷, 稱(chēng)重, 補(bǔ)足失重過(guò)濾后待用。

取1 mL 濾液到50 mL 具塞容量瓶中, 加入80%乙醇溶液到刻度處, 蓋上塞子搖勻。搖勻后精密量取供試品溶液5 mL, 置于10 mL 具塞比色管中[11］, 紫外分光光度計(jì)依次測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

在波長(zhǎng)476 nm 處檢測(cè)對(duì)照品溶液的吸光度, 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。以對(duì)照品吸光度為縱坐標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。蘆丁回歸方程為A=0.352 7C+0.005 4（R2=0.998 9）, 葛根總黃酮對(duì)照品濃度在0.4～2.4 μg/mL 符合Beer 定律[12］, 吸光度與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表2 線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密量取總黃酮對(duì)照品溶液制備顯色液, 重復(fù)測(cè)定6 次, 其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看出,RSD為0.02%, 表明試驗(yàn)精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取3.000 0 g 云南省葛根粉末6 份制備供試品溶液, 并分別在467 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定顯色后的吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮含量平均值及RSD, 結(jié)果見(jiàn)表4。從表4 可以看出,RSD為0.07%, 表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 冷凝回流提取法提取不同產(chǎn)地、不同時(shí)間葛根總黃酮

分別稱(chēng)取云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同地方葛根粉各3.000 0 g 置于錐形瓶中, 加入適量乙醇溶解后進(jìn)行冷凝回流, 結(jié)果見(jiàn)表5。并對(duì)不同產(chǎn)地樣品總黃酮含量進(jìn)行比較, 結(jié)果見(jiàn)表6、圖2。云南省葛根總黃酮提取最佳時(shí)間20 min, 黃酮含量為0.255 7%；廣東省葛根總黃酮提取最佳時(shí)間30 min, 黃酮含量為0.210 8%；廣西壯族自治區(qū)葛根提取最佳時(shí)間10 min, 總黃酮含量為0.213 2%；不同產(chǎn)地總黃酮含量：云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

圖2 不同產(chǎn)地葛根冷凝回流提取黃酮含量對(duì)比

表5 不同產(chǎn)地葛根冷凝回流測(cè)定試驗(yàn)

表6 不同產(chǎn)地、不同時(shí)間冷凝提取總黃酮含量

2.4 超聲波輔助提取葛根總黃酮

分別稱(chēng)取云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同地方葛根粉3.000 0 g 于錐形瓶中, 加入適量乙醇溶解后進(jìn)行超聲波輔助提取（表7）。并對(duì)不同產(chǎn)地葛根樣品總黃酮含量進(jìn)行比較, 各樣品的總黃酮含量見(jiàn)表8、圖3。云南省葛根總黃酮提取最佳時(shí)間20 min, 黃酮含量為0.171 5%；廣東省葛根總黃酮提取最佳時(shí)間30 min, 黃酮含量為0.155 9%；廣西壯族自治區(qū)葛根提取最佳時(shí)間30 min, 總黃酮含量為0.204 6%, 不同地區(qū)總黃酮含量：云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

表7 不同產(chǎn)地葛根總黃酮超聲波輔助提取試驗(yàn)

表8 不同產(chǎn)地、不同時(shí)間葛根總黃酮的含量測(cè)定

圖3 不同產(chǎn)地葛根超聲波輔助提取黃酮含量對(duì)比

3 小結(jié)與討論

近年來(lái), 通過(guò)檢測(cè)藥材中成分含量來(lái)確定被測(cè)藥材中成分的數(shù)量, 比較不同儀器提取成分含量評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量[13］。冷凝回流提取法提取工藝是指用有機(jī)溶劑提取藥材中的成分[14］, 將葛根藥材粗粉裝入容器中, 加適量的溶劑, 安裝冷凝裝置用恒溫水浴鍋進(jìn)行提取, 回流浸提到規(guī)定的時(shí)間, 將回流液進(jìn)行過(guò)濾, 得其濾液, 再進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。與超聲波提取法相比, 冷凝回流提取方法具有受外界溫度、壓力影響小, 不受氣液比的影響, 回收效果穩(wěn)定, 直接回收到有機(jī)液體, 無(wú)二次污染且、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[15］。

通過(guò)紫外分光光度法對(duì)云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)不同產(chǎn)地葛根進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。云南省總黃酮平均含量為0.257 7%；廣東省葛根總黃酮平均含量為0.210 8%；廣西壯族自治區(qū)總黃酮平均含量為0.213 2%, 葛根總黃酮含量云南省＞廣西壯族自治區(qū)＞廣東省。

綜上所述, 通過(guò)比較超聲波輔助提取和冷凝回流提取葛根總黃酮, 得出較科學(xué)、較簡(jiǎn)便的提取方法, 為提取葛根總黃酮的提供參考方法依據(jù)。同時(shí)對(duì)比分析了云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)3 個(gè)不同地方葛根總黃酮含量測(cè)定結(jié)果, 為后期葛根的規(guī)范化種植及合理開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù), 為葛根總黃酮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考價(jià)值。