多棘海盤車多肽的制備及其抑制ACE 活性研究

李敏晶，王 迪，胡 瀾，孫 慶，劉 上，焦雅倩

（大連海洋大學海洋科技與環境學院，遼寧大連 116023）

多棘海盤車（Asterias amurensis），是我國黃海沿岸一種十分常見的海星[1]，屬于海洋無脊椎動物，棘皮動物門、海星綱、鉗棘目、海盤車科、海盤車屬[2]。多棘海盤車體呈五星型，口面平坦為淺黃色，反口面較隆起，表面為紫紅色附有較多棘刺，是我國北方海洋海星的主要品種[3]。目前，國內外已有研究證明，海星中含有大量結構獨特的具有生物活性的活性物質，如甾醇[4-5]、多糖[6-8]、蛋白質[9]、皂苷[10-11]、脂肪酸[12]及神經酰胺[13]等，但對于多棘海盤車中蛋白質、多肽及氨基酸等活性組分報道較為少見。近年來，生物活性肽因具有抑制高血壓、抗凝血、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛關注[14]。

高血壓是當今世界最常見的心血管疾病。據報道，全球約1/3 的成年人口受到高血壓的影響[15]，而與高血壓治療相關的全球每年直接醫療費用估計為3 700 億美元[16]，而我國高血壓患病率呈逐年增長態勢，每5 個成人中就有1 人患高血壓；目前全國高血壓患者已超過2 億人?；瘜W合成類降壓藥的種類主要有利尿劑、α 受體阻斷劑、β 受體阻斷劑、血管緊張素轉換酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑、鈣通道阻滯劑等，已證明具有良好的降壓效果。但化學合成類降壓藥具有明顯的副作用，如頭痛、水腫、低血壓、心率過低、泌尿系統病變等等。因此，尋找來源于天然產物，具有明顯降壓效果且無副作用的降壓活性成分勢在必行。已有研究證明多棘海盤車中所含的組分具有多種多樣的生物活性，如溶血、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂等作用[17-26]，由于海星基本不具有食用價值，海星活性物質這一研究領域在國內也屬于偏冷的門類，研究還處于起步階段。大連有優越的地理條件，擁有豐富的海洋生物多樣性資源，因此對黃海產多棘海盤車中的多肽進行制備分離及抑制ACE 活性研究，以期為海星資源的高值利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海星，采自遼寧省大連黃海海域，經鑒定為多棘海盤車（Asterias amurensis）；血管緊張素酶（ACE，2.5 U）、馬尿酰- 組胺酰- 亮氨酸（HHL）、馬尿酸標準品（HIP），美國Sigam 公司提供；卡托普利，修正藥業集團提供；胃蛋白酶（1∶3 000）；木瓜蛋白酶（≥2 000 U/mg）；堿性蛋白酶（≥200 U/mg）；胰蛋白酶（1∶250）；還原型谷胱甘肽（M=300）、氧化型谷胱甘肽（M=600）、維B12（M=1 300）、細胞色素C（M=12 500）、牛血清白蛋白（M=67 000） 均為生物試劑；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；色譜實驗用水為超純水。

Waters 600 高效液相色譜儀（包括Waters 2478雙波長檢測器和Empower 工作站），美國Waters 公司產品；Kromasil C18色譜柱（5 μm，I.D.4.6 mm×250 mm）；BSA224S 型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；RE-52A 型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 多肽的制備

多棘海盤車多肽的制備流程圖見圖1。

圖1 多棘海盤車多肽的制備流程圖

1.2.2 ACE 抑制活性的測定

（1） ACE 抑制活性的檢測原理。ACE 酶在37 ℃條件下可以酶解HHL 生成HIP，HIP 在228 nm 下會產生吸收。當被檢測的樣品具有抑制ACE 活性時，HHL 的酶解反應會受到抑制，此時HIP 的生成量減少。因此，可通過HIP 含量的變化檢測待測樣品是否具有ACE 抑制作用。

（2） HPLC 測定條件。色譜柱：Agilent XBD C18（Agilent XBD C18），流動相：甲醇∶水= 30∶70（含有1 mL TFA、0.5 mL 冰乙酸），流速1 mL/min，檢測波長228 nm，柱溫25 ℃。

（3） 標準曲線和保留時間的測定。取一定量的HIP 和HHL 混合，搖勻后進樣20 μL，檢測HIP 和HHL 的出峰時間。根據保留時間和峰面積配置HIP的質量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 μg/mL，依次進樣20 μL，計算峰面積平均值，以峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標測定HIP 標準曲線。

（4） 反應時間的確定。取10 μL 的硼砂緩沖溶液，加入30 μL 的ACE，在37 ℃恒溫條件下加入50 μL 的HHL 溶液，分別持續反應10，20，30，40，50，60，80，100 min，然后加入10 μL 的10%TFA 溶液終止反應。分別測定HIP 的峰面積，平行測定3 次，通過下式計算ACE 抑制率（W）。

式中：W——樣品對ACE 的抑制率，%；

A——不含抑制劑的HIP 的峰面積，mAu；

B——含抑制劑的HIP 的峰面積，mAu。

（5） 樣品抑制ACE 活性分析。取10 μL 樣品，加入30 μL ACE，于37 ℃恒溫條件下加入50 μL HHL，充分混合，于37 ℃下反應40 min，加入10 μL 的10% TFA 溶液終止反應，按照1.2.2（4） 中的公式計算抑制率。

（6） P-1、P-2、P-3 分子量和含量的測定。①Sephadex G-25 標準曲線的繪制，在試驗優化洗脫條件下，分別測定還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、維B12、細胞色素C、牛血清白蛋白5 種分子量標準品在Sephadex G-25 凝膠層析柱中的保留時間，以保留時間為橫坐標，以標準品分子量的對數值為縱坐標繪制凝膠層析標準曲線圖。②含量與分子量的計算，在試驗優化條件下對P-1，P-2，P-3 分別進行Sephadex G-25 凝膠柱層析，測定保留時間洗脫曲線和峰面積，根據Sephadex G-25 標準曲線和梯形面積計算法測定3 種多肽樣品的分子量和含量。

2 結果與分析

2.1 保留時間確定

HPLC 色譜圖見圖2。

由圖2 可知，HIP 保留時間在10 min 左右，HHL 在100 min 左右，所以所選色譜條件下，HIP與HHL 之間互不干擾，試驗可行。采用試驗色譜條件下測定HIP 時，HIP 質量濃度與峰面積的線性關系良好，回歸方程為Y=11 239X-2 556.1，R2=0.999 1，最低檢出限為0.2 mg/mL，RSD 在1.9%～6.4%，說明該測定方法精密度良好。

圖2 HPLC 色譜圖

2.2 反應時間的確定

ACE 抑制活性反應時間確定見圖3。

圖3 ACE 抑制活性反應時間確定

由圖3 可知，在ACE 與底物HHL 反應到40 min時，HIP 的含量出現峰值，表明此時反應的活性最高。40 min 后的峰面積開始緩慢降低，反應60 min后峰面積基本沒有變化，表明在60 min 后反應達到平衡。

2.3 AP-P，PA-P，PE-P 抑制ACE 活性分析

酶解所得3 種多肽在相同條件下進行同質量濃度的活性檢測，得到ACE 抑制率結果。

3 種酶解多肽的ACE 活性抑制率曲線見圖4。

圖4 3 種酶解多肽的ACE 活性抑制率曲線

由圖4 可知，堿性蛋白酶水解多棘海盤車蛋白得到的多肽AP-P 的ACE 抑制活性顯著高于另外2 種酶酶解所得的多肽。在AP-P 的質量濃度達到10 mg/mL 時對ACE 的抑制率高達95.88%。用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解多棘海盤車得到的多肽PA-P 和PE-P 的ACE 抑制率也很高，在試驗最高質量濃度（10 mg/mL） 對ACE 的抑制率分別為88.5%，86.1%。PA-P 和PE-P 在質量濃度為0.2～2.0 mg/mL時，其質量濃度與抑制率大致呈線性關系，當質量濃度大于2 mg/mL 后，抑制率增長緩慢。PA-P 為0～1 mg/mL 時抑制率增長明顯，當質量濃度大于2 mg/mL后其對ACE 的抑制活性基本達到平衡，抑制率沒有顯著變化。根據對AP-P，PA-P，PE-P 抑制率的分析結果，最終得到AP-P，PA-P，PE-P 半抑制質量濃度IC50分別為0.332 8，0.552 6，0.682 7 mg/mL。

2.4 Sephadex G-25 標準曲線的繪制

在優化條件下對不同分子量的標準品進行洗脫，根據每種標準品出峰的保留時間和樣品對應的分子量的對數值作圖，得到Sephadex G-25 分子量標準曲線，該曲線的回歸方程式為：Y=-0.020 4X+4.966 8，相關系數R2=0.933 7，通過該方程估算所得的多棘海盤車多肽分子量。

P-1，P-2，P-3 分子量分布見表1，分子量標準曲線見圖5。

表1 P-1，P-2，P-3 分子量分布

圖5 分子量標準曲線

2.5 P-1，P-2，P-3 抑制ACE 的活性分析

對3 種不同分子量的多肽P-1，P-2，P-3 抑制ACE 活性進行分析。

P-1，P-2，P-3 的ACE 抑制活性分析（n=3）見表2。

表2 P-1，P-2，P-3 的ACE 抑制活性分析（n=3）

由表2 可知，當多肽分子量不同時對ACE 的抑制活性也有顯著差異，分子量小的多肽對ACE 的抑制活性最好，隨著分子量增加其抑制活性也逐漸減弱。說明多肽的分子量大小對抑制ACE 的活性影響比較顯著，小分子的多肽抑制ACE 活性表現更加顯著。

2.6 ACE 抑制活性對照分析

為對比樣品多肽對ACE 活性抑制的效果，試驗分析了目前市面上治療高血壓療效最好的“卡托普利”藥品的ACE 活性抑制。在卡托普利質量濃度達到0.2 mg/mL 時，對ACE 的活性抑制率已經達到99.99%，計算可知卡托普利的半抑制濃度IC50值為0.453 μmol/L，文獻中報道的卡托普利IC50值范圍在7.5×10-10～2.2×10-8mol/L，該方法測定結果也與其相符。

3 結論

通過HPLC 法測定胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶3 種蛋白酶對多棘海盤車酶解得到多肽樣品的ACE 抑制活性，結果表明，在試驗條件下，3 種酶解多肽均具有一定的抑制ACE 活性，其中堿性蛋白酶酶解所得多肽的ACE 抑制活性最好，木瓜蛋白酶次之，胃蛋白酶酶解所得多肽活性最差，它們的IC50值分別為0.682 7，0.552 6，0.332 8 mg/mL。對同種酶解（胰蛋白酶） 得到的多肽分析結果表明，當多肽的分子量不同時對ACE 的抑制活性也有顯著差異，分子量小的多肽對ACE 的抑制活性最好，隨著分子量增加其抑制活性也逐漸減弱。說明多肽的分子量大小對抑制ACE 的活性影響比較顯著，小分子的多肽抑制ACE 活性表現更加顯著。在相同濃度下對比市售的“卡托普利”藥品的ACE 抑制活性，多棘海盤車酶解多肽不具有明顯的優勢，其活性測定的結果比卡托普利要小得多。但天然提取物往往具有作用溫和、毒性小、多途徑、多靶點作用的特點，其作用機理可能是多方面的。而且海星屬于非經濟價值的海產品，因其不具有食用價值而常被作為廢棄物處置，同時由于海星的天敵較少，并對蛤蜊和海蠣子等經濟海產具有捕食作用，對于水產養殖業具有較大的危害，常會造成巨大經濟損失。2022 年3 月就有新聞報道涉及海星對于全國蛤蜊的重要養殖區- 山東青島膠州灣的入侵事件[27-28]，導致養殖戶損失慘重。因此，從天然產物海星中篩選高效、低毒的降低血壓活性的有效部位和有效成分，研究、開發利用海星具有很大的研究價值。