黑玉米芯醋酸發酵飲品工藝探究

楊小峰，李建東，張利斌，趙志剛

（1.忻州師范學院 生物系，山西 忻州 034000；2.忻州師范學院 附屬中學，山西 忻州 034000）

黑糯玉米是山西省忻州市特產，中國地理標志產品，備受人們青睞，在全國享有盛譽[1]。然而，黑玉米芯卻是廢棄物，被人們所丟棄。研究表明，黑玉米芯中含有纖維素、半纖維素、淀粉等多糖，經過降解可作為微生物發酵的碳源，此外，黑玉米芯中富含花青素，而花青素具有抗氧化、抗衰老、增強免疫和預防腫瘤等保健功能[2-5]。

木糖醇是人體糖代謝的中間體，可以直接進入人體細胞并參與新陳代謝，此過程不需要胰島素，因此血糖不會增高。木糖醇亦具有保護肝臟的作用，是糖尿病人和肝病患者理想的輔助治療劑和代糖品[6-7]。

醋酸飲品能促進新陳代謝，調節酸堿平衡，消除疲勞[8]。劇烈運動后，體內會產生大量乳酸，使人感覺酸痛疲勞，此時補充醋酸，能促進代謝恢復，消除疲勞。醋酸飲品目前以果醋居多[9]。

試驗以山西省忻州市特色農產品黑糯玉米的芯（常被遺棄） 為研究對象，用乙醇提取其中的花青素。將脫色碎芯作為微生物發酵的碳源，經醋酸菌發酵成飲品。此外，仍以黑玉米芯為原料制成的木糖醇作為調味劑，而非傳統的蔗糖，使得飲品可專供高血糖、糖尿病患者飲用。最后，將從黑玉米芯中提取的花青素按比例添加到飲品中，制備成口感較佳且極具營養價值的保健飲品。

1 材料與方法

1.1 材料

黑玉米，山西省忻州市玉米所提供；α - 淀粉酶（50 U/mg），邢臺萬達生物工程提供；纖維素酶（400 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg），上海源葉生物科技有限公司提供；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司提供；醋酸菌，康源生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

檸檬酸（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）、酚酞溶液、斐林試劑等。

1.3 儀器與設備

恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器表有限公司產品；電子天平，天津市天馬儀器廠產品；RE-2000B 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；WS70-1 型紅外快速干燥箱，鞏義市英峪予華儀器廠產品；752N 型分光光度計，上海儀器分析儀器有限公司產品。

1.4 方法

1.4.1 提取花青素并制備木糖醇

將黑玉米芯粉碎至顆粒狀，浸入含75%乙醇的平底燒瓶（1 L） 中，加檸檬酸調節pH 值為4.0，將平底燒瓶放入水浴鍋中，在60 ℃下回流提取2 次，每次8 h。布氏漏斗真空過濾后取濾液，60 ℃下將濾液在旋轉蒸發器上回收乙醇，得到花青素濃縮液[10-11]。

取粉碎后的黑玉米芯，加水（料液比1∶4），再加檸檬酸調節pH 值為2.0，攪拌均勻后倒入圓底燒瓶中，于60 ℃下水??；水浴結束后用布氏漏斗真空抽濾得玉米殘渣，將殘渣反復水洗至中性（pH 值=7），向殘渣中加水至浸沒玉米碎芯，放入恒溫培養箱中55 ℃下發酵48 h；發酵完成后，向玉米碎芯中加入質量分數為2%的稀硫酸溶液，攪拌均勻后于100 ℃沸水中水浴4 h；降溫至80 ℃，一邊攪拌一邊加入飽和碳酸鈣水溶液，調節pH 值至中性；利用布氏漏斗真空抽濾，過濾掉玉米碎芯和硫酸鈣沉淀，得濾液，置于旋轉蒸發儀上，回流、濃縮后得木糖醇[13-16]。

1.4.2 制備酶解液并檢驗其中還原性糖

取黑玉米脫色碎心40 g，加入240 mL 的蒸餾水，升溫到70 ℃，用碳酸氫鈉將pH 值調節為6.5，加入0.5%的α - 淀粉酶水解2 h；降溫至45 ℃，用飽和檸檬酸溶液調節pH 值至4.5，加入0.5%纖維素酶水解1.5 h；升溫到50 ℃，用碳酸氫鈉調節pH 值至7～8，加入0.1%中性蛋白酶水解2 h，最后將其放到100 ℃沸水中，滅酶10 min。用布氏漏斗過濾，收集濾液，即酶解液。

配置斐林試劑：質量分數為10%的NaOH 溶液（甲液），質量分數為2%的CuSO4溶液（乙液）。將2 mL 甲液和4～5 滴乙液混合制成Cu（OH）2懸濁液。

取10 mL 酶解液，滴加斐林試劑，若待測液中有葡萄糖，則會看到磚紅色沉淀。可根據沉淀的量判斷酶解液中還原性糖的含量。

1.4.3 酒精發酵

（1） 干酵母活化。按照葡萄糖∶干酵母∶蒸餾水= 0.5∶1∶10 的比例標準，稱取干酵母，加到蒸餾水中，然后再加入葡萄糖，于37 ℃的水浴中保持30 min，活化完成。將活化好的酵母液冷卻備用[17]。

（2） 單因素試驗。取出100 mL 的酶解液，倒入250 mL 的錐形瓶中，然后放入高壓滅菌鍋中，于121 ℃下滅菌20 min，將其溫度降至室溫后加入10%的活化酵母，再放入溫度為30 ℃的恒溫箱中發酵7 d。

（3） 正交試驗因素與水平。為了得到更好的玉米芯醋酸發酵工藝條件，在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，以發酵溫度（A）、pH 值（B）、活化酵母接種量（C） 和發酵時間（D） 作為考查因素。

酒精發酵條件優化正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 酒精發酵條件優化正交試驗因素與水平設計

1.4.4 醋酸發酵

（1） 醋酸菌活化。將葡萄糖加入無菌水中加熱溶解，冷卻后加入無水乙醇制成液體活化培養基，后將菌粉（0.5 g/100 mL） 接入活化培養基中，于32 ℃下恒溫培養24 h，備用。

（2） 單因素試驗。取出100 mL 的酒精發酵液，將其倒入250 mL 的錐形瓶中，在高壓滅菌鍋中，121 ℃下滅菌20 min。溫度降至室溫后加入10%的活化醋酸菌，再放入30 ℃的恒溫箱中發酵7 d。

（3） 正交試驗因素與水平。經過酒精發酵優化后，為了確定較好的玉米芯醋酸發酵工藝條件，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗，以酒精度（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C） 和接種量（D） 作為考查因素[17]。

醋酸發酵條件優化正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 醋酸發酵條件優化正交試驗因素與水平設計

1.4.5 調味并進行感官評價

加入5%花青素濃縮液進行調色；按0.5%加鹽進行調味，并抑制醋酸過度氧化；加入3%的木糖醇進行調味。

參考NY/T 2987—2016，取50 mL 樣品于透明玻璃杯中，在自然光亮處由10 人進行感官評價。對4個方面分別進行評分，總分為100 分，記錄評分結果，計算平均值。

感官評價評分細則見表3。

表3 感官評價評分細則

1.4.6 指標測定方法

參照GB 5009.266—2016 酒精計法測定酒精含量，參照GB 5009.239—2016 酸度法測定總酸度（以醋酸計），分別參照國標GB 4789.2—2010 和GB 4789.3—2010 測定菌落總數和大腸桿菌。

2 結果與分析

2.1 花青素和木糖醇的提取量

40 g 的黑糯玉米芯在上述條件下可提取出大約4 mL 的花青素濃縮液，40 g 的黑糯玉米芯在上述條件下可提取出大約10 mL 的木糖醇濃縮液。

2.2 酶解液中還原性糖的檢測

經過斐林試劑檢測，酶解液中出現大量磚紅色沉淀，表明酶解率較高。

2.3 酒精發酵的優化正交試驗結果

酒精發酵條件優化正交試驗結果見表4。

表4 酒精發酵條件優化正交試驗結果

由表4 可知，該酒精發酵的4 個因素中，較好的因素水平為A2B2C3D1，即溫度為30 ℃，pH 值為4.5，接種量為10%，發酵時間為5 d，各因素對試驗結果影響的主次為初始pH 值＞接種量＞發酵溫度＞發酵時間，以A2B2C3D1組合重復試驗2 次，得到酒精度為7.01%Vol。

2.4 醋酸發酵的優化正交試驗結果

醋酸發酵條件優化正交試驗結果見表5。

表5 醋酸發酵條件優化正交試驗結果

由表5 可知，該醋酸發酵的4 個因素中，較好的因素水平為A3B1C3D2，即酒精度為7.01%Vol，發酵時間為5 d，發酵溫度為32 ℃，接種量為10%，各因素對試驗結果影響的主次為酒精度＞接種量＞發酵溫度＞發酵時間，以A3B1C3D2組合重復試驗2 次，得到平均醋酸度為6.27 g/100 mL。

2.5 口感測評結果

口感測驗結果見表6。

表6 口感測驗結果

由表6 可知，該醋酸發酵的4 個因素中，能觀察出試驗7 是最好的，口感較佳、酸甜適中，且有淡淡的玉米清香。

2.6 理化指標和微生物指標

醋酸發酵飲品總酸為6.27 g/100 mL，符合NY/T 2987—2016 和GB/T 30844—2014 中相關標準。

飲品中檢出菌落總數3.4 CFU/g，大腸桿菌未檢出，符合質量標準要求[18]。

3 結論

酒精發酵與醋酸發酵是醋酸飲品釀造的重要環節，試驗以黑糯玉米芯作為原料，對其中花青素的提取和酒精發酵和醋酸發酵進行了工藝參數優化?；ㄇ嗨靥崛÷瘦^高條件為75%乙醇，溫度60 ℃，pH 值4.0；酒精發酵最優條件為溫度30 ℃，pH 值4.5，接種量10%，發酵時間5 d，得到酒精度7.01%Vol；醋酸發酵最佳條件為酒精度7.01%Vol，發酵溫度32 ℃，接種量10%，發酵時間5 d。此外，飲品以提取出的花青素為添加劑，增強了其保健功效；以提取的木糖醇為調味劑，而非傳統的蔗糖，使得飲品可專供高血糖及糖尿病患者飲用。