玉米粉糖化工藝優(yōu)化研究

溫 磊，李 麗，李遠(yuǎn)誼，宗緒巖

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

啤酒是以谷物為主要原料，輔以啤酒花，在酵母作用下發(fā)酵而成，是世界上最受歡迎的飲料酒[1]。啤酒工業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)食品行業(yè)中一個(gè)極為重要的產(chǎn)業(yè)，我國(guó)啤酒的年產(chǎn)量已位居世界第一，對(duì)啤酒釀造原材料的需求量也是極為龐大[2]。然而，作為啤酒釀造主要原料的大麥、大麥芽主要依靠進(jìn)口，直接導(dǎo)致了啤酒生產(chǎn)的成本升高[3]。針對(duì)這種情況，可在啤酒釀造時(shí)選擇其他谷物作為啤酒生產(chǎn)的輔料，如玉米、大米、小麥等谷物都是常用的輔料[4]。通過(guò)添加輔料可以降低原料成本，有研究證明30%的玉米輔料添加量可以降低8%的生產(chǎn)成本，同時(shí)，使用輔料還可以修飾啤酒感官品質(zhì)，控制啤酒風(fēng)味[5]。

然而，以玉米粉為輔料釀造啤酒時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)問(wèn)題，一是過(guò)高的脂肪含量會(huì)導(dǎo)致啤酒的泡沫性能差且口味較淡，二是游離α - 氨基氮含量低，三是不同的添加量會(huì)影響最終成品啤酒的風(fēng)味[6]。為了盡量減少添加玉米粉給啤酒釀造帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，試驗(yàn)使用了淀粉酶先將谷物進(jìn)行糊化，讓玉米里面的長(zhǎng)鏈多糖斷裂為短鏈多糖，易于后面的糖化，提高糖化的效率[7]，加入糖化酶，使多糖斷裂為葡萄糖，比傳統(tǒng)方法糖化酶從磨碎的麥芽中釋放，淀粉酶作用于淀粉，再使淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖更為穩(wěn)定，更能掌控各種酶的用量[8-9]。

試驗(yàn)通過(guò)研究最佳料液比、淀粉酶的選擇和用量、糖化酶的選擇和用量、pH 值對(duì)糖化結(jié)果的影響，以糖化液中的還原糖含量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)玉米粉的糖化效果。對(duì)減少啤酒釀造的工作量和周期提供了理論支持和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并且能降低啤酒釀造風(fēng)險(xiǎn)，讓糖化液中的成分變得可控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉，市售；淀粉酶，Liquoflow，諾維信（中國(guó)） 投資有限公司提供（本文縮寫(xiě)成N1）；Spezyme Alpha，杰能科（中國(guó)） 生物工程有限公司提供（本文縮寫(xiě)成J1）；C5，南京百斯杰生物工程有限公司提供（本文縮寫(xiě)成B1）；207A Pro，廣東溢多利生物科技有限公司提供（本文縮寫(xiě)成Y1）。

糖化酶：Suhong，諾維信（中國(guó)） 投資有限公司提供（本文縮寫(xiě)成N2）；杰能科糖化酶，杰能科（中國(guó)） 生物工程有限公司提供（本文縮寫(xiě)成J2）；百利醇A1，南京百斯杰生物工程有限公司提供（本文縮寫(xiě)成B2）；紅鷹糖化酶，廣東溢多利生物科技有限公司提供（本文縮寫(xiě)成Y2）。

氯化鈣、濃鹽酸、氫氧化鈉、3,5 - 二硝基水楊酸、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、96%乙醇，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

BHS-6 型電熱恒溫水浴鍋，寧波市群安試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；OHAUS AR2140 型電子分析天平，梅特勒- 托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；UV2400 型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糖化工藝流程

玉米粉→加水→加淀粉酶→液化→煮沸滅活→降溫→加糖化酶→過(guò)濾→檢測(cè)。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1） 按照料水比加入水，0.2%氯化鈣，調(diào)節(jié)pH值，并用玻璃棒攪拌使其與玉米粉充分混合；

（2） 加入耐高溫α - 淀粉酶并放入90 ℃水浴鍋中液化30 min；

（3） 將液化完畢的玉米粉放于沸水浴中煮沸2 min 將淀粉酶滅活；

（4） 將滅酶后的樣品放入冷水浴中降溫至60 ℃；

（5） 加入糖化酶于60 ℃水浴鍋中糖化1 h；

（6） 用濾紙將糖化液過(guò)濾，保留濾液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 糖化工藝單因素試驗(yàn)

針對(duì)玉米粉糖化，考慮淀粉酶品種、淀粉酶用量、液化時(shí)間、料液比、初始pH 值、蛋白酶用量、糖化酶品種和糖化酶用量等因素，然后以還原糖含量、α - 氨基氮含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)確定其對(duì)糖化液的影響，研究玉米粉糖化工藝的最優(yōu)條件。

1.3.4 糖化工藝正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇出對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的幾個(gè)單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以減小單因素試驗(yàn)過(guò)程中的誤差，進(jìn)一步考查在幾種單因素相互變化的情況下這些單因素的最佳試驗(yàn)條件。

1.3.5 還原糖的測(cè)定

采用3,5 - 二硝基水楊酸（DNS） 法對(duì)樣品中的還原糖進(jìn)行測(cè)定[10]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2021 軟件和Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用DPS 進(jìn)行模型計(jì)算，所有單因素試驗(yàn)均重復(fù)3 次，正交試驗(yàn)重復(fù)2 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)液化的影響

按照料液比1∶3～1∶8，自然pH 值，加入30 U/g的N1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶130 U/g（以干物計(jì)算）60 ℃下糖化30 min，并換算成料液比1∶5 情況下的還原糖質(zhì)量濃度，確定料液比對(duì)糖化產(chǎn)物的影響。

料液比對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖1 可知，隨著料液比的增加，糖化液中的還原糖質(zhì)量濃度也增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶5 時(shí)還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大，隨著料液比繼續(xù)增加，還原糖質(zhì)量濃度逐漸降低。這可能是由于料液比較低時(shí)，水分少，淀粉含量高，黏度大，與酶接觸少，造成水解不徹底[11]。當(dāng)料液比增加到一定程度時(shí)，水含量太大，稀釋了物料，也稀釋了酶，減少了酶與底物接觸和作用的幾率，也使得淀粉水解不夠徹底[12]。

2.2 淀粉酶的選擇

按照料液比1∶5，自然pH 值，分別加入30 U/g的不同淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶130 U/g（以干物計(jì)算）60 ℃下糖化30 min，確定淀粉酶對(duì)產(chǎn)物的影響。

淀粉酶種類(lèi)對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖2。

在液化過(guò)程中淀粉受到熱作用會(huì)發(fā)生糊化，使得體系黏度增加，同時(shí)體系中添加的耐高溫α - 淀粉酶會(huì)迅速水解糊化后的淀粉，造成黏度下降，出現(xiàn)液化現(xiàn)象[13]。由圖2 可知，不同的淀粉酶對(duì)產(chǎn)物影響較小，其中，溢多利的淀粉酶207A Pro 效果較好，即淀粉酶Y1。

圖2 淀粉酶種類(lèi)對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

2.3 淀粉酶用量的確定

按照料液比1∶5，自然pH 值，分別加入25～45 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶130 U/g（以干物計(jì)算） 60 ℃下糖化30 min，確定淀粉酶用量對(duì)產(chǎn)物的影響。

耐高溫α- 淀粉酶用量對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖3。

圖3 耐高溫α - 淀粉酶用量對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖3 可知，隨著耐高溫α - 淀粉酶用量的增加，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度在逐漸增加，當(dāng)耐高溫α - 淀粉酶用量達(dá)到40 U/g 時(shí)，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度逐漸趨于平緩，說(shuō)明玉米淀粉中大部分不溶性的淀粉類(lèi)物質(zhì)都已經(jīng)被分解成可溶性物質(zhì)[14]，即耐高溫α - 淀粉酶用量達(dá)到40 U/g 時(shí)液化基本徹底，當(dāng)繼續(xù)增加耐高溫α - 淀粉酶用量不能顯著增加后期還原糖生成。

2.4 液化時(shí)間的影響

按照料液比1∶5，自然pH 值，加入40 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下分別進(jìn)行糊化，液化10～50 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶130 U/g（以干物計(jì)算）60 ℃下糖化30 min，確定液化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的影響。

液化時(shí)間對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液化時(shí)間對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖4 可知，隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化液中的還原糖質(zhì)量濃度在逐漸增加，到液化30 min 后，還原糖質(zhì)量濃度變化趨緩，可能是由于隨著液化時(shí)間延長(zhǎng)，原料中淀粉類(lèi)不溶性成分，逐漸展開(kāi)，并與淀粉酶接觸，在淀粉酶的水解作用下，分解成了可溶的糊精類(lèi)物質(zhì)[15]，但淀粉酶主要起到切割大分子作用，當(dāng)?shù)矸垲?lèi)大分子物質(zhì)基本水解成可溶性糊精類(lèi)物質(zhì)后，其作用就較小了[16]，因此，繼續(xù)延長(zhǎng)液化時(shí)間，終產(chǎn)物中還原糖的變化就不明顯了。

2.5 糖化酶的選擇

按照料液比1∶5，自然pH 值，加入40 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入130 U/g（以干物計(jì)算） 的不同糖化酶，于60 ℃下糖化30 min，確定糖化酶對(duì)產(chǎn)物的影響。

糖化酶種類(lèi)對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖5。

圖5 糖化酶種類(lèi)對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

糖化酶在該試驗(yàn)中主要作用底物是經(jīng)過(guò)淀粉酶水解后的糊精，將較大分子的淀粉、糊精類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成麥芽糖、葡萄糖等還原性糖類(lèi)[17]。由圖5 可知，在所使用的4 種糖化酶中，糖化效果差異不大，相對(duì)效果較好的是，諾維信的糖化酶Suhong，即糖化酶N2。

2.6 糖化酶用量的確定

按照料液比1∶5，自然pH 值，加入40 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶90-130 U/g（以干物計(jì)算） 于60 ℃下糖化30 min，確定糖化酶用量對(duì)產(chǎn)物的影響。

糖化酶用量對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖6。

圖6 糖化酶用量對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖6 可知，隨著糖化酶用量的增加，糖化液中的還原糖質(zhì)量濃度在漸漸增加，當(dāng)用量到達(dá)120 U/g時(shí)，還原糖質(zhì)量濃度增長(zhǎng)趨于平緩，說(shuō)明試驗(yàn)中糖化酶較為適合的用量為120 U/g。說(shuō)明體系中溶解的糊精類(lèi)物質(zhì)基本被糖化酶水解，對(duì)于啤酒生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，并不是全部轉(zhuǎn)化成還原糖最好，需要保留一定的寡糖，提供一定的甜味和黏稠感[18]。

2.7 糖化時(shí)間的影響

按照料液比1∶5，自然pH 值，加入40 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶120 U/g（以干物計(jì)算）60 ℃下糖化20～60 min，確定糖化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的影響。

糖化時(shí)間對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖7。

圖7 糖化時(shí)間對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖7 可以看出，隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度逐漸上升，至糖化40 min 趨于穩(wěn)定，與工業(yè)化生產(chǎn)糖化時(shí)間基本一致。同時(shí)也需要注意，在糖化生產(chǎn)過(guò)程中，并不是為了獲得最大的還原糖質(zhì)量濃度，還需要適當(dāng)保留部分寡糖和短鏈糊精，以增加甜度和黏度，提高感官得分[18]。

2.8 pH 值對(duì)液化的影響

按照料液比1∶5，調(diào)整pH 值3.0～8.0，加入40 U/g 的Y1 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后加入N2 糖化酶120 U/g（以干物計(jì)算） 60 ℃下糖化40 min，確定液化pH 值對(duì)產(chǎn)物的影響。

pH 值對(duì)糖化產(chǎn)物的影響見(jiàn)圖8。

圖8 pH 值對(duì)糖化產(chǎn)物的影響

由圖8 可以看出，當(dāng)pH 值為4～7 時(shí)，隨著pH值的增加，糖化液中還原糖質(zhì)量濃度逐漸上升，至pH 值5.5～6.0 達(dá)到最高，然后開(kāi)始下降。通過(guò)查詢(xún)說(shuō)明書(shū)，耐高溫α - 淀粉酶和糖化酶的推薦pH 值為5.5～6.5，當(dāng)體系pH 值低于或高于最適pH 值，都會(huì)影響酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能[19]，試驗(yàn)最適pH 值為5.5～6.0，這是2 種酶共同作用產(chǎn)生的，可以認(rèn)為該過(guò)程的最適pH 值為5.5～6.0。雖然pH 值對(duì)與酶反應(yīng)速率影響很大，但鑒于廠(chǎng)家推薦的最適范圍和單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合，因此正交試驗(yàn)不考查該因素。

2.9 糖化工藝正交試驗(yàn)

從單因素試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，對(duì)糖化產(chǎn)物影響較大的因素包括耐高溫α - 淀粉酶用量、液化時(shí)間、糖化酶用量、糖化時(shí)間和pH 值，考慮到生產(chǎn)實(shí)際的設(shè)備利用率、安排生產(chǎn)問(wèn)題和產(chǎn)物組成因素，液化時(shí)間和糖化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)沒(méi)有意義，因此將另外3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，檢測(cè)糖化液中的還原糖質(zhì)量濃度。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，對(duì)正交數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析可以得出，對(duì)還原糖含量影響的重要順序?yàn)槟透邷卅? 淀粉酶Y1 用量＞糖化酶N2 用量＞pH 值。

2.10 預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸，獲得3 個(gè)因素的產(chǎn)物還原糖質(zhì)量濃度影響的數(shù)學(xué)模型：

Y=-1 130.26+425.21X3+0.030 1X1X1+0.009 47X2X2-

18.21X3X3+0.101X1X2-2.40X1X3-1.07X2X3.

該模型的R2=0.91，p=0.004 5，可以看出該模型具有較好效果，能夠進(jìn)行預(yù)測(cè)[20]。按照模型進(jìn)行偏導(dǎo)數(shù)求解，計(jì)算出當(dāng)X1=42，X2=124.64，X3=5.33 時(shí)，Y=105.42，即按照料液比1∶5，調(diào)整pH 值5.33，加入42 U/g 的Y1 耐高溫α - 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后，加入N2 糖化酶124.6 U/g，60 ℃下糖化30 min，糖化產(chǎn)物中還原糖質(zhì)量濃度可以達(dá)到105.42 mg/mL。

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)測(cè)模型得到的最佳工藝條件料液比1∶5，調(diào)整pH 值5.33，加入42 U/g 的Y1 耐高溫α - 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后，加入N2 糖化酶124.6 U/g，60 ℃下糖化30 min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到糖化產(chǎn)物中還原糖質(zhì)量濃度為105.01±1.06 mg/mL，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)結(jié)果與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果吻合。

3 結(jié)論

采用酶解法優(yōu)化了以玉米粉為糖化劑的啤酒釀造的糖化工藝，相比于傳統(tǒng)方法更為穩(wěn)定，更能掌控各種酶的用量，能降低啤酒釀造風(fēng)險(xiǎn)，讓糖化液中的成分變得可控，為減少啤酒的釀造成本和周期提供了理論支持和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明，玉米粉糖化的最佳工藝條件為料液比1∶5，調(diào)整pH 值5.33，加入42 U/g 的Y1耐高溫α - 淀粉酶，90 ℃下進(jìn)行糊化，液化30 min，煮沸滅酶冷卻后，加入N2 糖化酶124.6 U/g，60 ℃下糖化30 min。