酶催化合成L- 茶氨酸的純化研究進展

許錦雄，杜陽吉，王鈺佳

（廣東廣業清怡食品科技股份有限公司，廣東 廣州 511400）

L - 茶氨酸屬于酰胺類化合物，分子式為C7H14N2O3，是茶葉中獨有的游離氨基酸。大量研究結果表明L- 茶氨酸具有多種重要的生理功能，所以在食品、保健品、醫藥等領域得到廣泛的應用。目前市場上茶氨酸來源于化學合成、生物酶發酵，以及從天然茶樹中提取[1]。化學合成反應劇烈，合成過程中使用的有毒溶劑，且會產生D - 茶氨酸。從天然茶樹中提取L - 茶氨酸的效率最低，價格最貴。生物酶催化合成L - 茶氨酸反應溫和，且不會產生D- 茶氨酸。參考國內外有關文獻對L- 茶氨酸的酶法合成進行了概括，且重點對酶催化合成L - 茶氨酸的純化進行綜述，以期能對L - 茶氨酸的研究開發和綜合利用提供理論依據，為其生物合成工業化生產提供參考[2]。

1 酶催化合成L- 茶氨酸

在茶樹中，L - 茶氨酸合成酶（Theanine synthetase，TS） 在ATP 供能的條件下，催化L - 谷氨酸和乙胺合成L- 茶氨酸。Sasaoka 等人對L- 茶氨酸合成酶的研究表明該酶對乙胺具有高親合力，但易分解且難純化，L- 茶氨酸的體外合成是不合適的，因而制約了它在L- 茶氨酸的體外合成。

L- 茶氨酸合成酶催化合成L- 茶氨酸見圖1。

圖1 L- 茶氨酸合成酶催化合成L- 茶氨酸

隨著基因工程技術的進步，科研人員對酶促體外合成L- 茶氨酸進行了技術創新。

L- 茶氨酸體外合成見圖2。

圖2 L- 茶氨酸體外合成

1.1 L- 谷酰胺酸酶催化

L- 谷氨酰胺酶是一種酰胺基水解酶，催化L -谷氨酰胺的γ - 酰胺鍵水解為L- 谷氨酸和游離氨，在原核和真核生物中廣泛分布。

L- 谷氨酰胺酶催化見圖3。

圖3 L- 谷氨酰胺酶催化

孫帥[3]利用L- 谷酰胺酶催化L- 谷氨酰胺，系統以谷氨酰胺作為γ - 谷氨酰基給體，在反應過程中，谷氨酰胺易水解為谷氨酸。因此需要調整反應底物中的谷氨酰胺和乙胺的配比，以確保茶氨酸的產率最大化。研究得到谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸的最適反應條件：反應體系（0.3 mol/L 谷氨酰胺，1.8 mol/L乙胺溶液，2 U 粗酶液，1 mmol/L Ca2+溶液，pH 值9.8，濃縮1.3 倍），46 ℃下反應6 h[3-5]。從分析結果看，谷氨酰胺酶法合成茶氨酸的最佳工藝條件產率僅為0.239 g/L，這與茶氨酸的工業化生產的要求有很大差距。

1.2 γ - 谷氨酰轉肽酶（GGT） 催化

GGT 是一種能同時催化供體和受體基質的雙底物酶，在不同的生物源中具有相似的催化性質和特異性。GGT 的催化機理是通過向受體基質中的γ -谷氨酰基進行傳遞。在進行催化反應時，常采用2 個步驟進行，第一步用含有γ - 谷氨酰的化合物與對應的谷氨酰基結合，形成酶復合體；第二步，將結合的谷氨酰基轉移到對應的受體基質上，如氨基酸、乙胺、水等。

γ - 谷氨酰轉肽酶（GGT） 催化見圖4。

圖4 γ - 谷氨酰轉肽酶（GGT） 催化

從圖4 可以看出，在這一過程中， GGT 對不同的受體底物進行了不同的反應。當以乙胺為受體，產生了轉肽，從而生成了茶氨酸；在供體基質L-Gln同時充當受體的情況下，會產生自轉肽反應；當催化劑受體為水分子時，最終為水解反應。

劉栓英，傅嘉懿，呂晶晶，李依韋等人，和斐等人，Komera Irene 等人，黃鋒等人[6-12]用GGT 催化L- 谷氨酰胺與乙胺合成茶氨酸。在35 ℃，pH 值為10.0，0.2 mol/L L - 谷氨酰胺和2 mol/L 乙胺在酶質量濃度為1.0 U/mL 條件下反應得到茶氨酸38.33 g/L。通過分批加料茶氨酸產量可達58.73 g/L，茶氨酸的產率達60%。該方法可以運用在茶氨酸的工業化生產上，由于副產物較多，后續的純化分離具有挑戰性。

1.3 L- 谷氨酰胺合成酶（GS） 催化合成

GS（L- 谷氨酰胺合成酶） 以L- 谷氨酸鹽和游離銨鹽為原料催化合成L - 茶氨酸，同時通過三磷酸腺苷（ATP） 水解提供能量輔助反應的進行。從Pseudomonastaetrolens Y-30 中提取的GS 經過純化后具有生產L - 茶氨酸的能力。編碼P.taetrolens Y-30中GS 的基因序列已被測出，該序列能夠在大腸桿菌中成功表達。重組的GS 酶與原本GS 酶具有相同特性，但酶產量比原菌高出30 倍[13]。

GS 的催化反應要求持續供給ATP，所以還需要開發一種高效的ATP 再生技術用于L - 茶氨酸的GS 合成。在最佳工藝條件下，GS 催化合成L - 茶氨酸的收率達到28%。該收率較低，不適合工業化生產。

1.4 γ- 谷氨酰甲胺合成酶（GMAS） 催化合成

研究表明，GMAS 顯示出了比GS 更高的結合乙胺的能力。M.mays NO.9 來源的GMAS 在ATP 持續供能的條件下，生產L- 茶氨酸產率可達到110 g/L，遠超于P.taetrolens Y-30 來源的GS。此外，利用固定化酶的技術將該酶固定化在硅藻土等載體上可以持續進行6 次的高轉化率反應生產L- 茶氨酸。

朱新雅[14]利用GMAS 酶在溫度32 ℃，pH 值8.0，以L - 谷氨酸和乙胺的加入量均為150 mmol/L 作為反應物，細胞濕重為50 g/L，反應8 h 的條件下合成茶氨酸。此外還需在體系中加入50 mmol/L 硫酸鎂，100 mmol/L 六偏磷酸鈉，5 mmol/L ATP 用于ATP 循環的再生。最終，L- 茶氨酸的產量為20.68 g/L，轉化率為79.24%[15]。該方法雖然要加入ATP，但目前ATP 再生系統工業化應用成熟，加上其茶氨酸轉化率高，因此目前產業化生產茶氨酸主要利用該方法。

2 酶催化合成L- 茶氨酸的純化

為了酶的穩定催化，需要在反應體系中加入大量的磷酸鹽、金屬陽離子（Mg2+、Ca2+等），以及反應原料乙胺鹽酸鹽。由此可得，反應液的主要成分為陰陽離子，一部分變性蛋白、茶氨酸、谷氨酸。由于所有的物質均溶于水且不溶于大部分的有機溶劑，所以酶催化合成法比傳統的化學合成后續純化十分困難。根據反應液的組成，可以將純化過程分為3 步，分別是前處理過濾蛋白、細菌、脫色，除鹽工藝，精制茶氨酸。下面根據該3 步進行綜述。

2.1 前處理純化

酶通過工程菌發酵后破壁得到，因此反應液中存在破碎的細胞器、除工程菌外的雜菌以及部分變形蛋白。這些雜質大部分不溶于水，因此可以通過簡單的物理分離除去。

2.1.1 離心過濾

離心過濾法是最簡單的分離方法，在工業生產上運用成熟。通過離心，可以將大部分不溶性固體分離出來，再進行過濾可以得到清液。該方法分離速度快，且產物無損耗。其缺點也十分明顯，無法除去雜菌、色素及部分水溶性蛋白。通常在過濾后還需加入活性炭進行脫色處理，但雜菌仍然無法除干凈。

2.1.2 絮凝法

絮凝法用于除菌十分成熟，在谷氨酸的生產用十分常見，運用也十分成熟。通過加入化學絮凝劑，使得細菌等雜質被絮凝劑捕獲，經過過濾后可除去。然而絮凝法操作起來比較繁瑣，有時會產生毒性物質。而色素也無法通過該步驟完全除去[16]。

2.1.3 膜過濾

隨著材料學的不斷發展，誕生了膜過濾這一方法。微濾膜具高效分離0.1～10.0 μm 粒度的優點，操作簡單、綠色環保，適合用于L - 茶氨酸發酵液的菌體分離。超濾法也能用于分離分子量大于5 kDa的物質[17]。L- 茶氨酸發酵液大部分通過微濾膜和超濾膜組合進行初步分離提取。

膜通量是衡量膜性能的一個重要指標，即單位時間內通過單位膜面積的濾過液體積。由于膜孔直徑較小，在連續運行過程中容易出現堵塞，導致膜通量降低。影響膜通量的因素有許多，包括膜本身的性質。

發酵液體最大的特性就是黏度高，隨著黏度的增加，薄膜的滲透能力逐漸降低。隨著溫度的升高，其黏度也隨之下降；但溫度太高，微濾膜就會變得不穩定，細菌和其他不穩定的蛋白質會堵塞過濾膜，導致膜通量降低。

一般情況下，微濾膜的分離壓力為0.03～0.03 MPa。在過濾開始后，在濾膜的表面會逐漸形成少量的膠體，如果壓力差太小，過膜的動力就會減弱，從而使膜通量下降；如果壓差太大，凝膠層會變厚，密度增大，不僅直接堵塞過濾膜，還抵消外部的壓力，導致膜通量下降。

膜過濾的原料易得，且更換率低，雖仍然無法去除色素，但在眾多初級分離方法中分離效率最高。

2.2 除鹽純化

為了酶的催化效率，反應體系中加入了大量的輔助鹽，所以體系中雜質最多、最難除去的就是鹽，除鹽步驟對于分離純化至關重要。由于茶氨酸溶于水且難溶于有機溶劑，因此簡單萃取不能進行除鹽。目前的除鹽方法主要分2 種，一是衍生法，即對茶氨酸進行化學修飾來改變其性狀使得溶于某種溶劑或不溶于水，以此達到除鹽的目的；二是物理方法，即通過離子交換樹脂、大孔樹脂、C18反向色譜柱、電滲析等方法，分離鹽和茶氨酸。

2.2.1 沉淀法除鹽

利用特殊的有機試劑，按不同氨基酸的性質進行沉淀，實現與其他雜質的分離。在酶催化合成體系也適用，袁華等人[18]通過往加熱反應液至70 ℃，調節pH 值至中性，加入堿式碳酸銅得到紫色沉淀物，沉淀物用1 mol/L H2SO4溶解得到茶氨酸、碳酸銅混合液，通入H2S 氣體除去銅離子，加入適量氫氧化鋇沉淀硫酸根離子后得到茶氨酸[19]。

朱新雅[14]根據反應液的組成，計算后加入適量氯化銨，生成鳥糞石（Mg(NH4)PO4·6H2O），除去反應液中的磷酸根離子、鎂離子。再通過重結晶得到茶氨酸純品。

2.2.2 離子交換樹脂除鹽

工業中常用的氨基酸分離方法是離子交換樹脂法。茶氨酸的等電點是5.6 左右，因此可以根據要除去雜質的酸堿性選擇合適的離子交換樹脂及洗脫液，純化過程中不需要用到化學溶劑，綠色環保。

（1） 陽離子交換樹脂。茶氨酸是典型的兩性電解質，在pH 值低于5.6 的溶液中帶正電荷，從而能與陽離子樹脂上的交換基團結合。當pH 值大于5.6，茶氨酸失去正電荷從樹脂交換基團上脫落，達到除鹽目的[20-22]。

對D301、D380、724、732 這4 種常用的樹脂進行了靜態吸附試驗。724、732 型樹脂的再生性能比D301、D380 型要好，4 種樹脂中732 型樹脂吸附容量最大，同時吸附率也最高。

不同離子交換樹脂的交換特性見表1。

表1 不同離子交換樹脂的交換特性

使用陽離子交換樹脂需注意，溶液pH 值過高會導致陽離子樹脂出現滲漏情況，但L- 茶氨酸在pH值低于3.0 的溶液中很容易分解。上樣流速過高時，樹脂出現了滲漏，且洗脫液中L - 茶氨酸的濃度較低。洗脫液的氨水濃度太低時，洗脫曲線出峰滯后，峰寬較大，峰值也較小。

（2） 陰離子交換樹脂。陰離子交換樹脂純化原理與陽離子交換樹脂類似，當pH 值大于其等電點時，氨基酸帶負電荷，并與樹脂上的交換基團相結合吸附，當pH 值下降時，氨基酸的負離子鍵作用會減弱，從而被洗脫。

使用陰離子交換樹脂需注意，當pH 值＞8 時，吸附力明顯增加；pH 值8.5 時吸附最大；之后隨著pH 值的進一步增加，交換容量有所降低。

離子交換的一個重要參數是固液兩相的接觸時間，如果上樣液流速過快，來不及與樹脂交換，就會導致交換區高度拉長，發生滲漏現象。實際操作中流速控制為0.5 BV/h 比較適宜[23-27]。

（3） 離子交換樹脂結語。離子交換樹脂除鹽是最常用的手段，工業化應用十分成熟。一般反應液中包含鹽的種類較多，需要同時使用陰陽交換樹脂進行除鹽，可以將2 個系統進行串聯，即能完成除鹽。

但是需要注意離子交換樹脂的吸附量，一旦純化產品濃度大大超出，則無法進行純化。若需進行除鹽則需要對樣品進行稀釋，而稀釋會導致濃縮樣品的蒸汽用量增加。所以離子交換樹脂除鹽只適合鹽含量不高的樣品，否則缺乏經濟性。

2.2.3 大孔吸附樹脂除鹽

大孔樹脂不含離子交換基，但其微珠具有與被分離物體的分子大小相符的吸收位置和擴散通路，常呈白色球形，按其分子結構可劃分為無極性和極性2 種類型。高聚霞[31]發明了一種利用特制弱極性的大孔樹脂（JAD-1000） 吸附柱層析分離茶氨酸，用pH 值3.0 的洗脫液洗脫[28]。

D401 型螯合樹脂是一種氨基羧酸樹脂，含有亞氨基二乙酸基，能夠與二價金屬離子形成穩定的絡合結構，與金屬結合能力強，吸附能力強，操作簡單[29]。劉步云等人[28]利用該樹脂除去反應液中的Cu2+。在試驗考查的pH 值范圍內，樹脂對Cu2+的吸附量相差不大，且對茶氨酸的吸附量均很小，表明該樹脂在較寬的pH 值范圍內對Cu2+均具有很好的吸附選擇性[29]。

由于大孔樹脂并不能像離子交換樹脂定向吸附，因此其除鹽效果十分局限。體現在除鹽種類的局限性，除鹽效率低。因此利用大孔樹脂吸附除鹽后還需要再進一步純化，達不到產業化的要求。

2.2.4 電滲析除鹽

電滲析法是一種將陰離子交換膜和陽離子交換膜交替放置在正、負離子交換膜間，由專用的隔板分隔，構成脫鹽淡化和濃縮兩套體系。在直流電場的作用下，通過電位差作為驅動力，通過離子交換膜的選擇性滲透，使溶液與溶液分離，達到濃縮、淡化、精制和精制的目的。

當氨基酸溶液的pH 值在其等電點時，氨基酸溶液呈電中性，在直流電場中不發生移動；當溶液的pH 值小于等電點時，氨基酸呈電正性，在直流電場中可通過陽離子交換膜（C） 向陰極移動；當氨基酸溶液的pH 值大于等電點時，氨基酸呈電負性，在直流電場中可通過陰離子交換膜向陽極移動。因此可以采用電滲析技術對氨基酸溶液進行分離提純。

陳希書等人[30]利用電滲析技術對茶氨酸發酵液進行精制，具有較好的脫鹽效果。集中不同初始電導率情況下脫鹽時，脫鹽率都能達到85%左右，脫鹽效果比較明顯；在流量不同的情況下，脫鹽率也能達到要求，且脫鹽效果比較明顯，均具有一定的可行性。因此茶氨酸的電滲析脫鹽過程整體是可行的。

電滲析技術原理與離子交換樹脂相類似，但沒有離子交換樹脂的吸附容量的局限性，對含鹽量高的樣品也能進行純化，且不需要加入洗脫劑。分離過程利用電能作為動力，綠色環保。它還能通過多增加加濾膜，可以達到濃縮、脫色的效果。電滲析雖然會損失部分樣品，但對比其他除鹽方式，其純化效率也很高。

2.2.5 C18反相色譜柱

反相色譜（RPC） 是指以非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，利用溶質極性（疏水性） 差異對溶質分離純化。C18色譜柱常用在氨基酸的檢測上，利用水作流動相，能夠將茶氨酸與其他的鹽分離出來。

高聚霞[31]制備耐中壓的鋼化玻璃結構層析柱（40 mm×800 mm），填料是粒度30 μm 左右的C18。利用該層析柱，對樣品進行除鹽，得到茶氨酸質量分數98.2%，回收率72.5%。目前，已有企業利用C18反相色譜柱技術進行茶氨酸的工業化生產。

C18反相色譜柱技術目前主要用在HPLC 上，國外也有不少企業利用該技術進行分離。其對含鹽量要求不高，不需要額外加入溶劑，利用柱塞泵提供分離動力，綠色環保。該填料可以通過有機溶劑進行活化，活化后可重復利用，使用壽命長，維護成本低。雖然其前期投入成本很高，但純化過程產品無損耗，純化效率最高。

2.3 精制茶氨酸

通過除鹽后的茶氨酸含量大多達到98%左右，因此需要對其進一步的精制才能達標。精制步驟則主要是為了將水溶液的茶氨酸取出，因此大多數通過改變溶液極性，或濃縮得到產品。

2.3.1 有機溶劑沉析

因為茶氨酸在有機溶劑中溶解度低，加入乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯改變溶劑極性后，茶氨酸會析出，再經過濾，烘干即可得到及格產品。

該方法雖然十分簡單，但由于有機溶劑的殘留問題，通常使用乙醇進行沉析。

2.3.2 重結晶

重結晶原理與上一種方法類似，一般只能用乙醇、甲醇進行重結晶。重結晶使用的溶劑十分巨大，不具有經濟性。但重結晶得到的產品是晶體，是所有方法中堆積密度最高、不易起塵的。因此，重結晶得到的產品售價更高。

2.3.3 凍干

冷凍干燥是指先對溶液進行降溫凍結成固體，在真空的條件下使固態水直接升華分離，而物質本身留在凍結時的冰架中，因此它干燥后體積不變。該方法得到的產品不會因為加熱過高引起產品變黃、炭化的問題。

3 結語

由于高效、節能、環境友好等優點，酶催化合成L - 茶氨酸日益受到青睞，目前占具25%的市場份額。

在傳統發酵工業中，分離純化的投入占據整個工廠投資的60%，而基因重組的工程菌發酵過程，分離純化部分的投入占據整個投資的80%～90%。因此，分離純化技術成為茶氨酸能否進行工業化生產的關鍵點。目前，茶氨酸工業化生產并不采用單一的分離純化技術，而是多種分離純化技術的結合，隨著分離純化技術的不斷發展，茶氨酸的分離越來越高效。

工業化純化茶氨酸舉例見圖5。

圖5 工業化純化茶氨酸舉例