甘薯IbGATA16基因的克隆與表達分析

王崇 王連軍 雷劍 靳曉杰 柴沙沙 鄒語嫣 楊新筍 程賢亮 焦春海 田小海

摘??要：GATA類轉錄因子在調控植物響應非生物脅迫中發揮重要作用。本研究從甘薯中克隆出1個IbGATA16基因，對其進行生物信息學分析，并對IbGATA16基因在甘薯干旱和鹽脅迫處理中的表達模式進行分析。結果表明：甘薯IbGATA16基因CDS序列全長420?bp，編碼139個氨基酸，蛋白分子量為15.39?kDa，等電點為9.97；IbGATA16基因組全長為582?bp，包含3個外顯子和2個內含子；IbGATA16為不穩定的親水性脂溶蛋白，亞細胞定位預測顯示該蛋白定位于細胞核，具有C-X2-C-X17-C-X2-C結構域，屬于典型的GATA類轉錄因子。IbGATA16基因上游1382?bp的啟動子序列存在多種順式作用元件，如MYB、ABRE、GARE-motif等。多重序列比對和系統進化樹分析結果顯示，IbGATA16蛋白與三裂葉薯ItGATA16的親緣關系最近，N端的鋅指結構域序列高度一致，表明二者可能具有相似的功能。實時熒光定量結果表明，IbGATA16在甘薯根、莖、葉片等組織中均有表達，在葉中的表達量顯著高于莖與根的表達量。IbGATA16對干旱和鹽脅迫顯著誘導表達，在干旱和鹽脅迫處理0、1、3、6、12、24?h后，IbGATA16的表達量均顯著高于0?h。干旱脅迫下，IbGATA16的表達量在1?h時達到峰值；在鹽脅迫下，IbGATA16的表達量在3?h時達到最大值。以上結果表明，IbGATA16基因參與了甘薯對干旱和鹽脅迫的應答響應，在根、莖和葉中的調控存在差異。本研究為進一步揭示IbGATA16在甘薯中抵御逆境脅迫的機理提供參考。

關鍵詞：甘薯；轉錄因子；IbGATA16；非生物脅迫；表達模式中圖分類號：S531??????文獻標識碼：A

Clonging?and?Expression?Analysis?of?IbGATA16?in?Sweet?Potato

WANG?Chong1，2，?WANG?Lianjun2*，?LEI?Jian2，?JIN?Xiaojie2，?CHAI?Shasha2，?ZOU?Yuyan2，?YANG?Xinsun2，?CHENG?Xianliang2，?JIAO?Chunhai2**，?TIAN?Xiaohai1**

1.?College?of?Agriculture，?Yangtze?University，?Jingzhou，?Hubei?434025，?China;?2.?Institute?of?Food?Corps，?Hubei?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Wuhan，?Hubei?430064，?China

Abstract：?GATA?transcription?factors?play?an?important?role?in?regulating?plant?response?to?abiotic?stress.?In?this?study，?an?IbGATA16?gene?was?cloned?from?sweet?potato?and?analyzed?by?bioinformatics.?The?expression?pattern?of?IbGATA16?gene?in?sweet?potato?under?drought?and?salt?stress?was?analyzed.?Experimental?results?show?that?the?full?length?of?IbGATA16?CDS?sequence?is?420?bp，?and?it?encodes?139?amino?acids.?The?molecular?weight?of?IbGATA16?was?15.39?kDa，?isoelectric?point?was?9.97.?The?full?length?of?the?genome?is?582?bp，?including?3?exons?and?2?introns.?IbGATA16?is?an?unstable?hydrophilic?lipid-soluble?protein.，?and?its?subcellular?localization?predicts?that?the?protein?is?located?in?the?nucleus.?It?has?the?C-X2-C-X17-C-X2-C?domain?and?belongs?to?the?typical?GATA?class?of?transcription?factors.?There?are?many?cis-acting?elements?in?the?1382?bp?upstream?promoter?sequence?of?IbGATA16?gene，?such?as?MYB，?ABRE，?and?GARE-motif.?The?results?of?multiple?sequence?alignment?and?phylogenetic?tree?analysis?showed?that?IbGATA16?protein?was?closely?related?to?ItGATA16.?The?sequence?of?the?N-terminal?zinc?finger?domain?is?highly?consistent，?suggesting?a?possible?similar?function.?The?results?of?real-time?fluorescence?quantification?showed?that?IbGATA16?was?expressed?in?root，?stem?and?leaf?tissues?of?sweet?potato，?and?the?expression?level?of?IbGATA16?in?leaves?was?significantly?higher?than?that?in?stem?and?root?tissues.?IbGATA16?was?significantly?induced?by?drought?and?salt?stress，?and?after?0，?1，?3，?6，?12?and?24?h?of?drought?and?salt?stress，?the?expression?of?IbGATA16?was?significantly?higher?than?that?of?0?h.?Under?drought?stress，?the?expression?of?IbGATA16?reached?its?peak?at?1?h，?and?under?salt?stress，?the?expression?of?IbGATA16?reached?the?maximum?at?3?h.?IbGATA16?positively?responds?to?drought?and?salt?stress?in?sweet?potato.?These?results?indicated?that?IbGATA16?gene?was?involved?in?the?response?of?sweet?potato?to?drought?and?salt?stress，?and?the?regulation?of?IbGATA16?gene?was?different?in?roots，?stems?and?leaves.?This?study?provides?a?reference?for?further?research?on?the?biological?function?of?IbGATA16?and?its?mechanism?in?response?to?stress?in?sweet?potato.

Keywords：?sweet?potato;?transcription?factors;?IbGATA16;?abiotic?stress;?expression?pattern

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.013

甘薯[Ipomoea?batatas（L.）Lam.]是重要的糧食、飼料、工業原料和新能源作物，是世界第七大糧食作物，中國第五大糧食作物[1]。我國甘薯產業規模大，種植面積和年產量均位居世界首位[2]。干旱和鹽脅迫是影響甘薯生長發育的主要環境因素，干旱會導致甘薯生長緩慢、發育遲緩，鹽脅迫對甘薯的根長、株高有顯著影響，嚴重情況下造成甘薯死亡[3]。挖掘并克隆抗旱和耐鹽相關基因、培育抗旱和耐鹽作物新品種是解決因土壤干旱和高鹽導致作物減產的有效途徑之一。

隨著科學技術的發展，越來越多與植物抗逆相關的轉錄因子被鑒定，包括GATA類[4]、MYB類[5]、NAC類[6]、WRKY類[7]、AP2/ERF類[8]等。GATA轉錄因子家族能夠識別GATA基序，可以特異性地結合WGATAR序列（W為T或A，R為G或A），因此，被命名為GATA轉錄因子。GATA類轉錄因子首次發現于雞的珠蛋白基因啟動子上，參與雞的造血過程[9-10]。隨后又研究鑒定出GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5和GATA-6等基因，由此形成了GATA轉錄因子家族[11]。除了分布于動物之中，GATA類轉錄因子還廣泛地存在于植物、真菌等生物中。真菌中的GATA轉錄因子大部分只含有1個鋅指結構域，分為2類：C-X2-C-X17-C-X2-C和C-X2-C-X18-C-?X2-C，在光形態建成、晝夜節律、結合型轉換和氮循環等多種生物學過程中發揮重要作用[12]。與真菌GATA轉錄因子功能相似，植物GATA轉錄因子在植物光響應調控、葉綠素合成、細胞分裂素響應以及碳、氮代謝和響應逆境脅迫等生物學過程中發揮重要作用[4]。植物中大部分GATA轉錄因子含有C-X2-C-X18-C-X2-C和C-X2-C-X20-C-?X2-C鋅指結構[13]，植物中首個GATA轉錄因子NTL1在煙草中鑒定出來，并對其功能進行了分析研究[14]。目前，GATA轉錄因子在多種植物中都有深入研究，如擬南芥（Arabidopsis?thaliana）[13]、水稻（Oryza?sativa）[15]、番茄（Lycopersicon?esculentum）[16]、辣椒（Capsicum?annuum）[17]和棉花（Gossypium?genus）[18]等。GATA轉錄因子在植物響應逆境脅迫中發揮著重要作用，在干旱脅迫下，高粱（Sorghum?bicolor）的SbGATA11和SbGATA26的表達量顯著上調，在高粱響應干旱脅迫時發揮重要作用[19]。

甘薯是我國重要的糧食作物之一，在我國糧食生產領域有著十分重要的地位。甘薯在我國主要種植于干旱或者鹽堿地帶，隨著頻發的干旱和高溫等非生物逆境危害嚴重制約我國甘薯產業的發展。通過對甘薯響應逆境脅迫的研究，克隆相關基因，創制抗旱耐鹽新品種，可有效減輕干旱和鹽脅迫對甘薯產量和品質的影響，對保障我國糧食安全和促進生物質能發展具有重大意義。目前，GATA轉錄因子家族在甘薯逆境脅迫響應中的研究報道較少。本研究以甘薯品種鄂薯11為材料，克隆得到1個GATA類轉錄因子基因IbGATA16，對該基因進行生物信息學分析，并對不同逆境（干旱和鹽脅迫）處理下的基因表達模式進行分析，旨在探究IbGATA16基因在逆境脅迫中的表達特性，為甘薯抗旱耐鹽育種提供有參考價值的基因資源，并為揭示甘薯抗旱耐鹽機理研究奠定基礎。

1??材料與方法

1.1??材料

供試材料為鄂薯11甘薯品種，由湖北省農業科學院糧食作物研究所選育，種植于湖北省農業科學院鄂州試驗基地。

1.2??方法

1.2.1??甘薯總RNA提取及cDNA合成??使用FastPure??Universal?Plant?Total?RNA?Isolation?Kit（Vazyme，?Wuhan）提取鄂薯11葉片的總RNA。用超微量分光光度計檢測總RNA的質量和濃度。使用TransScript??All-in-One?First-Strand?cDNA?Synthesis?SuperMix?for?qPCR（One-Step?gDNA?Removal）（Trans，?Wuhan）反轉錄合成cDNA第一鏈，反應體系為：Total?RNA?1?mg，5×TransScript??SuperMix?4?mL，gDNA?Remover?1?mL，使用RNase-free?water補充至總體積為20?mL；反應程序為：42?℃孵育15?min，85?℃加熱5?s。反轉錄得到的cDNA于?20?℃保存備用。

1.2.2??IbGATA16基因克隆??基于前期的轉錄組數據篩選到GATA16基因，利用轉錄組中的基因序列與六倍體甘薯參考基因組數據庫（https：//ipomoea-genome.org/）進行比對，獲得IbGATA16的CDS序列。使用Primer?Premier?5軟件基于CDS序列設計特異性引物（IbGATA16-F：?5?-ATGGA TCTGA ATGAGCAAATGA-3?；IbGATA16-R：?5?-CT AG G C GTAAACAGAGCCGT-3?）。使用IbGATA 16-F/R引物對cDNA進行PCR擴增，反應體系為cDNA?2?mL，10×LA?PCR?Buffer?5?mL，LA?Taq?0.5?mL，dNTP?Mix?8?mL，IbGATA16-F/R引物各1?mL，ddH2O?32.5?mL。反應程序為：94?℃預變性5?min；94?℃變性30?s，55?℃復性30?s，72?℃延伸1.5?min，35個循壞；72?℃延伸10?min，10?℃保存。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行檢測，使用EasyPure??Qcick?Gel?Extraction?Kit（Trans，?Wuhan）回收擴增產物，純化后的DNA連接到pMD?19-T載體（TaKaRa，?Beijing），轉化到DH-5α大腸桿菌感受態細胞（Trans，?Wuhan），挑選單克隆進行測序及分析，獲得IbGATA16的CDS序列。根據IbGATA16基因起始密碼子上游1400?bp左右啟動子序列設計特異性引物（IbGATA16-ProF：?5?-CATCGACAGGTACCCAAGGT-3?;?IbGATA16-?ProR：?5?-GGTGGTGTGACAATCACTGC-3?），以鄂薯11的葉片基因組DNA為模板，擴增得到IbGATA16基因的啟動子序列。使用引物IbGATA16-F/R擴增鄂薯11的葉片基因組DNA，得到IbGATA16的基因組DNA序列。

1.2.3??IbGATA16基因序列的生物信息學分析??使用Primer?Premier?5軟件推導出IbGATA16基因編碼的氨基酸序列，并在NCBI（https：//www.ncbi.?nlm.nih.gov/）的BlastP程序中查找同源氨基酸序列；使用DNAMAN?8.0軟件進行多序列比對，采用MEGA?7.0軟件的Neighor-joining法構建IbGATA16的同源序列進化樹。參考劉意等[20]的方法，對IbGATA16基因進行生物信息學分析。使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.?be/webtools/plantcare/html/）在線工具分析啟動子順式作用元件。

1.2.4??IbGATA16基因表達模式分析??提取鄂薯11甘薯生長3個月大田苗的葉片、莖、根的總RNA，反轉錄成cDNA，對IbGATA16在甘薯不同組織中的表達進行分析。田間剪取鄂薯11材料，放入1/2霍格蘭溶液中馴化7?d，然后分別培養在含有200?mmol/L?NaCl、20%?PEG-6000的1/2霍格蘭溶液中，處理0、1、3、6、12、24?h后取樣，提取葉片總RNA并反轉錄成cDNA，對IbGATA16基因在不同逆境處理后的表達量進行分析。根據IbGATA16的ORF序列，以甘薯β肌動蛋白基因作為內參基因，使用Primer?Premier?5設計熒光定量特異性引物（IbGATA16-QF：?5?-T G CG GGATCAAGTACAACAA-3?，IbGATA16-?QR：?5?-TCCTCCTCTCGCAACTGACT-3?.?β-Actin-?F：?5?-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAG CA C-3?，?β-Actin-R：?5?-TGGAAAATTAGAAGCACT TC C T GTGAAC-3?），參考劉意等[20]的方法進行實時熒光定量反應。

1.3??數據處理

使用2?ΔΔCT計算IbGATA16基因的相對表達量，數據表示為3個獨立重復的平均值±標準誤差，使用SPSS?26.0軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗。

2??結果與分析

2.1??IbGATA16基因的特性分析

以鄂薯11甘薯的cDNA作為模板，擴增得到的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小約450?bp的單一條帶，與預期大小一致（圖1）。回收測序后，分析得知IbGATA16基因的CDS全長為420?bp，編碼139個氨基酸。Pfam在線分析結果顯示，IbGATA16在21～77?aa包含1個ZnF-GATA（C-X2-C-X17-C-X2-C）結構域，屬于典型的GATA類轉錄因子。同時擴增得到582?bp的IbGATA16基因組全長序列，包含3個外顯子和2個內含子（圖2）。

2.2??IbGATA16基因的生物信息學分析

經ProtParam在線軟件分析，IbGATA16分子式為C643H1077N213O205S10，預測蛋白分子量為15.39?kDa，等電點（pI）為9.97，為堿性蛋白。該蛋白帶16個負電荷（Asp+Glu）和28個正電荷（Arg+Lys）殘基，不穩定系數86.08，為不穩定蛋白。利用ProtScale分析IbGATA16的親水性，IbGATA16蛋白的親水性總平均值（GRAVY）為-0.971，脂溶指數為57.63，結果表明該蛋白為親水性脂溶蛋白。TMHMM在線軟件（https：//services.?healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測顯示IbGATA16蛋白不包含跨膜結構域。SignalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-?6.0/）在線預測發現IbGATA16不存在信號肽結構，表明該蛋白不屬于分泌蛋白。使用在線軟件Cell-Ploc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-?PLoc-2/）和PSORT?II（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位分析，結果顯示IbGATA16轉錄因子定位于細胞核。對IbGATA16蛋白的二級結構和三級結構進行預測，IbGATA16蛋白二級結構包含48.92%的α-螺旋結構、5.04%的延伸結構、2.88%的β-轉角結構和43.17%的無規則卷曲結構。使用SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.?org/）網站對IbGATA16蛋白進行同源建模，結果顯示其三級結構模型與二級結構預測結果一致，具有較多的α-螺旋和無規則卷曲結構（圖3）。

2.3??IbGATA16啟動子順式作用元件分析

以鄂薯11甘薯的基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到大小約1400?bp的片段，與預期一致（圖4A），測序結果顯示該序列長度1382?bp。使用PlantCARE在線網站對IbGATA16基因上游啟動子序列區域的序列進行分析，該區域不僅包含啟動子的基本作用元件、光應答相關元件，還存在多個與抗逆相關的順式作用元件，包括2個脫落酸應答元件（ABRE）、1個赤霉素應答元件（GARE-motif）、1個MYB識別位點和1個MYB結合域等，說明該基因可能與甘薯的逆境脅迫響應相關（圖4B，表1）。

2.4??IbGATA16蛋白進化分析

將IbGATA16編碼的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行Blast，下載不同物種的同源氨基酸序列。使用DNAMAN?8.0軟件將IbGATA16與不同植物的GATA16氨基酸序列進行多重序列比對，發現10個GATA16蛋白具有GATA類轉錄因子的共有特點，N端氨基酸相對保守，包含C-X2-C-X17-?C-X2-C結構域，C端氨基酸序列則更加多樣化（圖5）。推測IbGATA16與ItGATA16、ShGATA16等GATA類轉錄因子具有相似的生物學功能。使用MEGA?7.0軟件的Neighor-joining法構建22個不同物種中GATA16同源蛋白的進化樹，22個GATA16蛋白被歸為兩大類（Ⅰ，Ⅱ），IbGATA16與三裂葉薯ItGATA16親緣關系密切，被歸類到Ⅰ類，與楊梅MrGATA16、葡萄VrGATA16、歐洲油菜BnGATA16等親緣關系較遠（圖6）。

2.5??IbGATA16基因的表達特性分析

采集3個月大小的鄂薯11甘薯大田苗的葉片、莖和根進行qRT-PCR分析，探究IbGATA16在甘薯不同組織中的表達情況。結果顯示，IbGATA16在根、莖和葉中均有不同程度的表達，在葉中的表達量顯著高于莖和根，分別是莖和根中表達量的3.16倍和7.57倍（圖7A），推測IbGATA16基因在甘薯葉片的形成中起到重要調控作用。

對甘薯在20%?PEG-6000、200?mmol/L?NaCl處理后葉片中的IbGATA16表達量進行分析。結果顯示，在20%?PEG-6000脅迫處理0～24?h期間，葉片中的IbGATA16表達量顯著呈上調趨勢，在1?h時達到最大值，表達量為0?h的5.05倍（圖7B）。

在200?mmol/L?NaCl脅迫處理0～24?h期間，IbGATA16均處于誘導上調狀態，其中IbGATA16在3?h達到峰值，為0?h的5.40倍（圖7C）。在非生物脅迫（干旱、高鹽）處理下，IbGATA16基因的表達量均表現出不同程度的上調，推測IbGATA16參與了甘薯對干旱、高鹽等脅迫信號的應答反應。

3??討論

GATA類轉錄因子是植物中廣泛分布的轉錄因子家族之一，在植物的生長發育和脅迫響應中發揮著重要的調控作用。楊樹中過表達GATA類轉錄因子PdGNC，己糖激酶活性顯著提高，促進保衛細胞NO和H2O2的產生，降低氣孔開度，轉基因楊樹的抗旱能力得到提高[21]。在擬南芥中過表達PdGATA13，促進氣孔關閉，轉基因植株的抗旱能力顯著提高[22]。甘薯GATA類轉錄因子的不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

功能研究報道較少，通過分析甘薯GATA轉錄因子家族基因，可深入了解GATA轉錄因子家族基因在甘薯中發揮的作用，為甘薯的抗逆育種挖掘新的基因。

本研究從鄂薯11中克隆到1個GATA類轉錄因子基因IbGATA16，與三裂葉薯ItGATA16的同源性最高。亞細胞預測其定位于細胞核，SMART分析顯示IbGATA16的N端包含1個保守結構域C-X2-C-X17-C-X2-C，屬于典型的GATA類轉錄因子。預測IbGATA16為不穩定的親水性脂溶蛋白，對于IbGATA16的序列特征和理化性質有進一步的了解。順式調控元件能與轉錄因子特異性結合，在基因轉錄起始調控中起到重要調控作用[23]。通過擴增得到IbGATA16基因的啟動子序列，序列大小為1382?bp，對IbGATA16基因啟動子序列進行分析，結果顯示該基因上游啟動子區域含有多個激素應答和環境脅迫應答順式調控元件，包括MYB結合域、ABRE和GARE-motif等，表明IbGATA16基因可能參與甘薯響應逆境脅迫的調控。

植物中基因的時空表達模式具有特異性，與該基因的生物學功能有著密切聯系。GATA類轉錄因子在不同組織中的表達存在差異，馬鈴薯StGATA12基因在馬鈴薯根、葉、花和塊莖中均有表達，在花和葉中的表達量高，在花器官發育起著重要作用[24]。本研究發現，IbGATA16基因在甘薯的根、葉和莖中均有表達，在葉中的表達量最高，揭示IbGATA16基因在不同部位的調控機制存在不同，推測IbGATA16在甘薯葉片響應干旱和鹽脅迫等過程中發揮著重要作用。研究發現，不同GATA基因的表達模式也有不同，楊梅MrGATA1和MrGATA10基因在芽和小果實中表達量高；MrGATA7在葉片中表達量高，在芽、小果實等組織中表達量低[25]。表明不同GATA基因可能在不同組織部位參與不同的生理過程，通過克隆更多的甘薯GATA基因，對于該類基因的功能將會有更加全面了解。

干旱和鹽脅迫是制約作物生長和產量形成的主要因素，尋找抗旱和耐鹽基因對于提高植物的抗逆性具有重要意義。研究發現，過表達甘薯IbGATA24基因的轉基因擬南芥植株的抗旱和耐鹽能力顯著提高[26]。本研究中，2種非生物脅迫（干旱、高鹽）處理甘薯幼苗之后，IbGATA16的表達量在0～24?h內均顯著上調。在鹽脅迫下，IbGATA16的表達量在3?h達到最大值；在干旱脅迫下，IbGATA16的表達量在1?h達到峰值，IbGATA16基因可能在甘薯響應干旱和鹽脅迫過程中起到重要作用。

綜上，本研究完成了甘薯IbGATA16基因的克隆、生物信息學分析和表達模式分析。本研究表明IbGATA16基因正響應干旱和鹽脅迫，IbGATA16基因可能在甘薯響應干旱和鹽脅迫過程中起到重要作用，為甘薯的抗旱和耐鹽品種改良提供重要參考，后續可使用轉基因植株進一步驗證IbGATA16基因的功能。

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