金線蓮資源遺傳多樣性分析及耐熱性評價

李和平 張樹河 林江波 鄒暉 戴藝民

摘??要：金線蓮（Anoectochilus?roburghii）是具有極高經濟價值的珍稀瀕危蘭科藥用植物，高溫是制約其廣泛生產栽培的首要限制因子，選育耐熱品種是抵御高溫熱害最經濟有效的措施之一。本研究利用目標起始密碼子多態性（SCoT）分子標記技術對24份金線蓮種質資源進行遺傳多樣性分析，并利用多元統計分析的方法對其中20份樣本進行耐熱性評價。遺傳多樣性分析結果顯示：在遺傳系數0.602水平上，可以把金線蓮種質分成I和II兩大類，I類分成A和B兩個亞群，臺灣金線蓮（TJ）與其他資源遺傳距離較遠，單獨歸為II類；A亞群中除了W來源于云南，其他均為福建西北部收集的資源；B亞群主要來自閩南地區和廣西。通過對20份金線蓮資源5個生理參數測定，發現熱處理后葉綠素含量和SOD活性明顯下降，相對電導率明顯升高，而丙二醛和可溶性蛋白含量熱處理后各資源表現不一。利用多元統計分析方法進行耐熱性初步評價，結果顯示，TL、L1、A20、GZ1等4份資源較為耐熱，TJ、HX、L、M、A21等5份資源不耐熱。

關鍵詞：金線蓮；SCoT；遺傳多樣性；耐熱性中圖分類號：S567.239??????文獻標識碼：A

Analysis?of?Genetic?Diversity?and?Evaluation?of?Heat?Resistance?of?Anoectochilus?roburghii

LI?Heping，?ZHANG?Shuhe，?LIN?Jiangbo，?ZOU?Hui，?DAI?Yimin*

Institute?of?Subtropical?Agriculture，?Fujian?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Zhangzhou，?Fujian?363005，?China

Abstract：?Anoectochilus?roburghii?is?a?rare?and?endangered?medicinal?orchid?with?high?economic?value.?High?temperature?is?the?primary?limiting?factor?for?its?extensive?production?and?cultivation.?Breeding?heat-resistant?varieties?is?one?of?the?most?economical?and?effective?measures?to?resist?heat?damage?caused?by?high?temperature.?In?this?study，?we?analyzed?the?genetic?diversity?of?24?A.?roburghii?germplasm?resources?by?Start?codon?targeted?polymorphism?（SCoT）?molecular?markers，?and?evaluated?the?heat?tolerance?of?20?samples?by?multivariate?statistical?analysis.?The?results?of?genetic?diversity?analysis?showed?that?at?the?genetic?coefficient?was?0.602，?A.?roburghii?germplasm?could?be?divided?into?two?groups：?I?and?II，?Group?I?was?divided?into?two?subgroups?A?and?B，?Anoectochilus?formosanus?was?classifiedd?into?Group?II?alone.?In?subgroup?A，?except?W?from?Yunnan，?all?the?other?resources?were?collected?in?the?north?and?west?of?Fujian.?Subgroup?B?mainly?came?from?Southern?Fujian?and?Guangxi.?The?cluster?diagram?showed?that?the?relatives?of?A.?roburghii?from?the?same?origin?was?close，?and?the?presence?or?absence?of?reticulated?veins?was?not?the?basis?for?the?classification.?Five?physiological?parameters?were?measured?in?the?20?samples.?It?was?found?that?the?chlorophyll?content?and?SOD?activity?decreased?obviously?after?heat?treatment，?and?the?relative?conductance?increased?obviously，?while?the?malondialdehyde?and?soluble?protein?contents?of?each?resource?were?different?after?heat?treatment.?The?preliminary?evaluation?of?heat?resistance?was?conducted?by?the?multivariate?statistical?analysis?method，?and?the?results?showed?that?four?resources?（TL，?L1，?A20，?GZ1）?were?heat?resistant，?while?five?resources?（TJ，?HX，?L，?M，?A21）?were?not.

Keywords：?Anoectochilus?roburghii?（Wall.）?Lindl;?Start?codon?targeted?polymorphism?（SCoT）;?genetic?diversity;?heat?resistance

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.015

金線蓮[Anoectochilus?roburghii?（Wall.）?Lindl]是蘭科開唇蘭屬多年生常綠草本植物，產于中國、日本、斯里蘭卡、印度、尼泊爾及東南亞各國。開唇蘭屬植物全世界有40余種，我國有20種，2個變種，其中部分種的全草在民間用以入藥，為珍貴的中藥材[1-3]。金線蓮來源廣泛，有些種外形較相似，且金線蓮葉片表面又存在從無金色網紋到有金色網紋的過渡類型[2]。因此，僅通過外形來鑒定金線蓮存在極大難度。鄭純等[4]曾做過福建金線蓮和廣西金線蓮的生藥鑒定，但用傳統的形態組織學無法區別二者遺傳上的差異。利用分子標記技術對金線蓮資源進行遺傳關系分析不僅可以排除生長環境和生長期的影響，還有助于雜交育種親本的選擇，為金線蓮資源優良基因的發掘和利用提供參考。

金線蓮對生態環境要求嚴格，特別是對溫度較為敏感，適宜生長溫度為20～25?℃，超過35?℃不適宜其生長[5]。金線蓮人工種植主要集中在我國南方省區，夏季長期高溫是普遍現象，而冬季低溫天數較少，夏季高溫是制約金線蓮廣泛生產栽培的首要限制因子，選育耐熱品種是抵御高溫熱害最經濟有效的措施之一。目前，多元統計分析已在植物耐熱性評價中有較多應用，如小麥耐熱性[6]、玉米耐熱性[7]和香蔥耐熱性[8]等，使用該方法獲得的耐熱性鑒定結果與品種在田間的耐熱表現基本一致，可有效地避免單一耐熱指標的片面性與局限性，較全面地評價作物的耐熱性。本研究對收集的金線蓮資源在組織培養階段進行耐熱性評價，可以盡可能地確保樣本生長環境和個體大小的一致性，并縮短優異種質的篩選時間。

1??材料與方法

1.1??材料

分子標記使用材料：24份金線蓮資源取自福建省農業科學院亞熱帶農業研究所組培室培養的金線蓮組培苗，采集各樣品的正常葉片，裝入編號袋，在–80?℃冰箱中保藏備用。

試驗耐熱性生理參數測定材料：由于4份金線蓮資源是新收集資源，樣品量不足，且田間種植各資源同一時間采樣時長勢不一致，個體大小存在較大差異，因此取20份金線蓮資源組培苗進行相關生理參數測定與分析。挑選長勢一致的金線蓮，利用恒溫光照培養箱，設置溫度35?℃、相對濕度70%、光照4000～5000?lx、每天光照時間12?h等條件，培養時間5?d，然后全株采樣，混合后分成3個生物學重復。

試劑：2×PCR?Mix購自北京聚合美生物技術有限公司，CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、RNase?A、瓊脂糖、引物等分子生物學使用試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他生理參數測定試劑購自漳州市騰信化玻儀器有限公司，均為國產分析純試劑。

1.2??方法

1.2.1??SCoT分析??使用CTAB法提取金線蓮葉片基因組DNA，挑選12條多態性較好的SCoT引物（表2）對24份供試材料進行PCR擴增反應，優化后的PCR反應體系為（20??L）：2×PCR?Mix?10??L，DNA?50?ng模板，10??mol/L引物1.5??L。反應程序為：94?℃預變性3?min；94?℃變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，循環35次；72?℃終延伸5?min，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像系統上拍照保存。

SCoT數據分析：根據電泳圖結果，對擴增清晰且易于辨認的條帶采用0-1系統記錄其位置，在同一遷移位置，有條帶（強帶或清晰弱帶）記為“1”，無條帶記為“0”。并建立分子數據矩陣，利用NTSYS-pc2.1軟件分析，計算遺傳相似系數并按UPGMA方法聚類分析。

1.2.2??生理參數測定??參照李合生[9]的方法測定金線蓮葉片中葉綠素含量、相對電導率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白含量。

1.3??數據處理

采用WPS?Office?Excel軟件進行原始數據的整理和簡單分析；采用SPSS?17.0數據處理軟件進行相關性分析、主成分分析和聚類分析。

公式如下：

如果指標與耐熱性呈正相關（葉綠素、SOD活性、可溶性蛋白、脯氨酸）：

隸屬函數值U（Xj）=（Xj－Xmin）/

（Xmax－Xmin） （1）

如果指標與耐熱性呈負相關（相對電導率、丙二醛）：

隸屬函數值U（Xj）=1－（Xj－Xmin）/

（Xmax－Xmin） （2）

式中，j=1，2……n，Xj表示第j個指標；Xmin表示第j個指標的最小值；Xmax表示第j個指標的最大值；權重（W）和綜合評價值（D）計算公式參見湯佳樂等[10]的方法。

2??結果與分析

2.1??收集保持金線蓮資源描述

從福建省內外收集24份金線蓮資源，于實驗室離體保存和大棚種植，大棚種植4個月后，對正常金線蓮植株進行拍照（圖1）和形態學描述（表1）。本研究選用穩定性較好的葉脈、葉片上表面顏色和葉片長寬比3個指標來描述金線蓮形態學特征。形態學特征參考中國植物志，初步將葉脈分為金色、白色及無變色葉脈，葉片形狀按長寬比區分，葉表面分為紫紅、黃色及綠色。結果可以看出大多數金線蓮資源有金色葉脈，少量資源無葉脈，只有臺灣金線蓮葉脈為白色，葉片長寬比最大的是資源B，比值達到1.45，葉片為卵形，而葉片長寬比最小的是資源M，比值達到0.98，葉片為卵圓形。

2.2??金線蓮資源遺傳多樣性分析

從40條SCoT引物中挑選12條多態性較好、條帶清晰且穩定的引物，引物擴增條帶多態率見表2，其中引物SCoT9的擴增圖譜見圖2。通過數據分析，構建金線蓮種質資源的系統進化樹（圖3）。聚類結果發現在遺傳系數0.602的水平上，可以把金線蓮種質分成兩大類：I類和II類，其中I?圖中字母代碼表示不同來源，詳細信息見表1。

類分成A和B兩個亞類群，臺灣金線蓮遺傳距離較遠，單獨歸為一類。A亞群中除了W來源于云南，其他均為福建西北部收集的資源，W與HJ和N關系較近；從聚類圖中可以看出，同來源地的金線蓮親緣關系較近，且有無網狀葉脈不作為金線蓮分類依據，如M和M1，TL和TL1，L和L1，GZ1和GZ2。B亞群主要來自閩南地區和廣西，其中大部分是來自福建長泰和廈門，圖中顯示C和HX親緣關系較近（HX來源于C自交種子繁殖），這說明SCoT分子標記技術在金線蓮親緣關系鑒定方面是可以使用的較好的標記方法。

2.3??金線蓮各單項指標測定結果分析

由表3可知，熱處理后所有資源葉綠素含量均有降低，其中降幅最大的是HX、TJ和H，降幅不明顯的是C、G和M1；相對電導率均有升高，其中漲幅最大的是M1、TJ和W，漲幅最不明顯的是HJ、N和GZ1；丙二醛含量熱處理后各資源變異明顯，其中漲幅最大的是L、W和C，降幅最大的是M、GZ2和N；熱處理后金線蓮資源SOD活性降低，降幅最大的是GZ1、A20和W，降幅較少的是K、HX和TJ；可溶性蛋白含量熱處理前后各資源表現不一，其中漲幅最大的是A20、TL和GZ1，降幅最大的是A21、M和TJ。

2.4??耐熱性綜合評價

利用SPSS?17.0軟件對5個單項指標的耐熱系數進行主成分分析（表4），按初始特征值大于1確定主成分個數為3個，前3個綜合指標的貢獻率分別為0.316、0.253、0.209，累計貢獻率達0.778，表明前3個綜合指標反映了原指標的絕大部分信息，可以代替原來的5個生理指標，其余可以忽略不計。根據主成分分析的表達式和公式求出每個金線蓮種質材料的所有綜合指標值CI（x）和隸屬函數值U（x），詳見表5。用公式計算各個種類的綜合耐熱能力的大小，根據D值（表5）對其耐熱性進行強弱排序。其中TL的D值最大，表明其耐熱性最強；其次為L1，臺灣金線蓮TJ的D值最小，表明臺灣金線蓮TJ的耐熱性最差。采用最大距離法對D值進行聚類分析，可將20個金線蓮種質材料劃分為3類?：TL、L1、A20、GZ1為Ⅰ類，D值大于0.6，屬耐熱類型；F、K、N、C、G、H、W、HJ、GZ2、M1、Y作為Ⅱ類，D值大于0.4小于0.6，屬中度耐熱類型；其余5個金線蓮種質D值小于0.4，屬不耐熱類型。

3??討論

本研究挑選12條SCoT引物從24份金線蓮資源中獲得70條清晰的多態性條帶，根據個體間UPGMA聚類分析，發現福建、廣西和云南收集的資源未依據地理差異單獨聚類，體現了不同地區個體遺傳差異與地理距離的相關性較小，而臺灣金線蓮與國內收集的金線蓮資源遺傳距離較遠，被聚類在最外層。秦朋[11]、葉煒等[12]的研究結果同樣顯示福建、廣西和云南金線蓮種質資源間親緣關系較近，臺灣金線蓮與國內金線蓮遺傳距離較遠的現象。此外，民間將無線類型金線蓮稱為公、有線類型金線蓮稱為母，鄭純等[4]發現有線與無線金線蓮種質在顯微及理化分析方面存在一致性，認為二者是同種植物，而胡珊梅等[13]通過RAPD分子標記發現二者存在較大差異，建議分別獨立成種。本研究中，有線和無線類型金線蓮是與相同來源地的不同單株聚類在進化樹末端，表明有線與無線的金線蓮基因型較為相似，是同種植物，此結果與鄭純等研究結果一致。

高溫是影響植物生長發育的重要非生物因子，當溫度高于植物正常生長溫度時，植物就會產生熱激反應，產生各種生理生化變化，如改變細胞穩定性，改變激素和次級代謝物的合成，甚至死亡[14-15]。通過對種質材料的耐熱性進行篩選、鑒定和評級歸類，可以為耐熱性育種提供優異的種質材料。目前，我國在金線蓮品種耐熱性鑒定及評價標準方面尚未規范統一，缺乏可操作性。鑒定指標的合理選擇是耐逆性評價的關鍵。前人關于冬瓜幼苗[16]、灌漿期小麥[6]、棉花苗期[17]等從生理機制角度對植物耐逆性進行準確評價，為金線蓮耐熱性鑒定提供了參考指標。由于種質資源間的差異，金線蓮生長緩慢、開花結果難，形態學性狀測量過程復雜、耗時耗力。因此，本研究從生理機制角度對其耐熱性進行評價，選擇葉綠素含量、相對電導率、丙二醛含量、SOD活性和可溶性蛋白含量5個生理生化指標，通過主成分分析將眾多指標轉化為3個綜合指標，在主成分得分的基礎上利用模糊隸屬函數法計算綜合評價D值，依據D值判斷耐高溫能力的強弱，從中篩選了4份耐熱種質材料。本研究在金線蓮中對其耐熱性進行初步評價，篩選出的耐熱資源將為耐熱金線蓮品種選育提供參考。

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