UPLC-MS/MS 法檢測乳制品中3 種內源性雌激素及其代謝產物的含量

樊亞光，朱盈蕊，榮劍鋒，李 琦，李杜娟

（鄭州市食品藥品檢驗所，河南鄭州 450000）

類固醇類激素在生理學中起著多種生物反應的調節器作用，包括細胞代謝、炎癥、免疫功能、壓力管理、發育和生理學等。類固醇激素又稱為甾體激素，是由腎上腺皮質、卵巢和睪丸中的膽固醇通過代謝途徑合成的，類固醇激素的產生或代謝異常是內分泌疾病發生的原因，甾體激素失調會造成女性月經失調、青春期提前、乳房提前發育等異常現象；也會造成男性精子質量下降等異常情況[1]。雌激素可造成機體免疫失調等病理反應[2]。雌激素活性物質主要分為內源性雌激素和外源性雌激素，內源性雌激素主要是人體和動物體自身分泌的激素，如雌醇、雌酮、雌二醇等[3]。

當前，動物源性食品中雌激素的檢測方法主要包括液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-串聯質譜法、免疫分析法等[4-5]。但是因為前體和代謝物結構相似，且在生物樣品中濃度較低，很難同時確定多種雌激素，對日常檢測造成了不便[6]。常用的免疫分析法具有基質干擾，與結構相似的代謝物交叉激活的準確性不足，靈敏度不高，檢測范圍有限[7]等缺點。基于質譜的色譜方法，如GC-MS/MS和LC-MS/MS，被認為是目前主流的檢測方法，但氣相色譜-質譜聯用法需要衍生化步驟，使雌激素在氣相中揮發或增加電離性質，但衍生步驟、非特異性質譜裂解和結合雌激素的可能水解會損害樣品的通量和準確性，阻礙其在實際應用中的實用性[8-9]。為了檢測復雜樣品中的低水平雌激素，進行UPLCMS/MS 檢測前的樣品制備至關重要。如今檢測已經可以采用多種樣品制備技術，現有方法分析一次只能評估一種或兩種類固醇激素，而同時測量多種類固醇可節省極大的物料成本及時間成本。現有方法多采用正負離子相結合的方式，而本文開發和驗證了液相色譜-質譜/質譜的新方法，只采用正離子模式，無需任何衍生步驟，使用0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相，通過Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱純化樣品，深入研究了內源性雌激素的檢測，通過不同前處理方法之間的比較，可以一次定量分析包括雌激素、孕激素、雄性激素等3 種內源性激素及其衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

甲酸（電子純，美國fisher 公司）；乙腈（色譜純，美國fisher 公司）；乙酸（色譜純，美國fisher 公司）；雌酮（Estrone、E1）、雌二醇（Estradiol、E2）、雌三醇（Estriol，E3），純度均大于97%，購自TRCCANADA 公司；實驗用水為超純水。3 種標準物質信息見表1。

表1 3 種標準物質信息

1.1.2 儀器

Waters?Xevo TQ-S 微串聯質譜儀配電噴霧電離（ESI）源，Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制

使用十萬分之一天平準確稱取3 種雌激素及其衍生物各10 mg，分別加入到3 個10 mL 的棕色容量瓶中，使用適量甲醇溶解，再進行定容，搖勻，配成 1.0 mg·mL-1的標準溶液儲備液，-18 ℃避光存放。使用移液槍分別吸取3 種雌激素各0.1 mL，使用70%甲醇水定容至10 mL 容量瓶中，配制成10 mg·L-1的中間液，使用時根據需要配制成5 ng·mL-1、 10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的標準溶液。所有中間液避光存放在-18 ℃冰箱中。

1.2.2 樣品前處理

使用含0.1%甲酸的酸化乙腈對樣品進行提取，與陽性基質樣品渦旋振蕩15 min，超聲提取 15 min，-4 ℃低 溫 離 心，10 000 r·min-1離 心 15 min，取上清液4 mL 凈化。凈化柱選擇Oasis PRiME HLB Cartridge。將上清液轉移至固相萃取柱，重力過柱，收集濾液，直接過濾膜進樣。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

為了避免不同填料的色譜柱的影響，本研究選擇Waters?Acquity UPLC C18HILIC BEH（100 mm× 2.1 mm，2.1 μm）、Waters?Acquity UPLC C18BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters?Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3 種 色 譜 柱。經 對 比 后 發 現，Waters?Acquity UPLC C18BEH （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離效果最好。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B 為含有0.01%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫見表2，柱溫40 ℃，流速：0.2 mL·min-1，進樣量10 μL。

表2 流動相條件

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子快速切換掃描模式；毛細管電壓：3. 0 kV（ESI+）；錐孔電壓：35 V（ESI+）；錐孔氣流量：150 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量： 1 000 L·h-1；碰撞氣流速：0.18 mL·min-1；霧化氣壓力：0.7 MPa；采用多離子反應監控（MRM）掃描方式。質譜優化MRM 參數見表3。

表3 3 類內源性雌激素的質譜優化參數

2 結果與分析

2.1 標準曲線

使用70% 甲醇水溶液將中間液配制成5 ～ 500 ng·mL-1的標準曲線，以峰面積（Y）為縱坐標，以濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示3 種內源性雌激素及其衍生物在5 ～500 ng·mL-1線性良好。相關系數（R2）均≥0.990，檢出限為0.5 ～ 1.0 ng·mL-1，定量限為1.5 ～3.0 ng·mL-1，詳見表4。

表4 3 類內源性雌激素及其代謝物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

2.2 回收率與精密度

為了評價該方法的有效性，測定了回收率和日內精密度等參數。將高（70 ng·mL-1）、中（40 ng·mL-1）、低（10 ng·mL-1）3 個濃度的標準溶液加入空白陰性樣品，回收率為80.20%～105.92%，日間穩定性（n=3）為4.7%～11.5%，詳見表5。這些結果表明，該方法所提供的穩定性是合理的，適用于常規分析。

表5 3 類內源性雌激素及其代謝物的加標回收率及相對標準偏差（n=3）

3 結論

本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法建立了一種同時測定乳制品中3 種內源性雌激素的檢測方法，無需衍生化和復雜步驟，選擇含0.1%甲酸的酸化乙腈為提取溶劑，Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱凈化，使用含0.1%甲酸水溶液和含有0.1%甲酸甲醇溶液為流動相，得出的結果線性關系良好。本方法快速、便捷，應用范圍廣，具有較高的靈敏度、選擇性和準確性，易于實現高通量處理，適用于乳制品中內源性雌激素及其代謝物含量的分析。此外，該方法還有較強的擴展性，對于多種基質中內源性雌激素及其衍生物的檢測都具有可借鑒性，可進一步開展新的研究。