UPLC 法測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1

楊雅雯，張美秀，蒲小春

（美廬生物科技股份有限公司，江西九江 332000）

黃曲霉毒素M1是一種有機(jī)化合物，主要用于新陳代謝和致癌性的研究。由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將其列為1 類致癌物[1]。當(dāng)哺乳動(dòng)物食用黃曲霉毒素污染的食物后，代謝物會(huì)分泌到乳汁中造成污染[2-3]。黃曲霉毒素M1的檢測方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[4-6]、液相色譜法[6-9]和酶聯(lián)免疫法[6,10]等。其中酶聯(lián)免疫法檢測操作快速、方便，檢測成本相對(duì)較低，應(yīng)用廣泛；液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，但液質(zhì)聯(lián)用法所需設(shè)備昂貴，檢測成本高。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24——2016）中規(guī)定使用酶聯(lián)免疫法檢出有黃曲霉毒素M1時(shí)，需使用液相色譜法或是液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行確認(rèn)。在使用液相色譜法檢測黃曲霉毒素M1時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素M1對(duì)液相色譜儀熒光檢測器的靈敏度要求較高，一般的熒光檢測器靈敏度度無法滿足GB 5009.24——2016 中規(guī)定的特殊膳食食品中黃曲霉毒素M1檢出限為0.02 μg·kg-1的要求。本研究采用超高效液相色譜儀（Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UPLC）的快速高通量熒光檢測器進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測，并對(duì)液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇，色譜級(jí)，F(xiàn)isher；氯化鈉、氯化鉀，分析純，天津永大；磷酸氫二鈉，分析純，西隴化工；磷酸二氫鉀，分析純，西亞試劑；鹽酸，分析純，科隆化學(xué)品；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，浙江月旭。黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，上海安譜。

超高效液相色譜儀（配有熒光檢測器），Waters；分析天平，賽多利斯；水浴鍋，江蘇金怡；旋渦振蕩器，海門其林貝爾；超聲波清洗儀，國環(huán)高科；離心機(jī)，湖南湘儀；固相萃取儀，博納艾杰爾；氮吹儀，奧盛儀器。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18柱，100 mm× 2.1 nm，1.7 μm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A 相為水，B相為乙腈。等度洗脫條件：A，70%；B，30%。流速： 0.2 mL·min-1。熒光檢測波長：發(fā)射波長365 nm；激發(fā)波長：435 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.3 μg·mL-1）用乙腈稀釋成濃度為103 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 至10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，配制為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和 5.150 0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

樣品提取參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24——2016）第二法高效液相色譜法12.1 進(jìn)行處理后，樣液備用。

1.4.2 凈化

免疫親和柱取出恢復(fù)至室溫。將免疫親和柱連接于50 mL 注射器下，空氣壓力泵與免疫親和柱連接，免疫親和柱內(nèi)的液體放空后，將上述樣液移至 50 mL 注 射 器 筒 中， 調(diào) 節(jié) 壓 力 使 溶 液 以2 ～ 3 mL·min-1（1 ～2 滴/s）流 速 緩 慢 通 過 免 疫 親 和柱，至溶液全部抽空。更換10 mL 注射器與親和柱連接，在注射器中加入10 mL 水，調(diào)節(jié)壓力使水以 6 mL·min-1流速清洗親和柱；準(zhǔn)確加入4 mL 乙腈洗脫，流速為1 ～2 mL·min-1，收集全部洗脫液于玻璃試管中，在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑贸跏剂鲃?dòng)相定容至1 mL，渦旋30 s 溶解殘留物，用 0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長選擇

在相同儀器條件下噪音水平相當(dāng)，峰高越高靈敏度越高。對(duì)比不同波長的響應(yīng)效果，在其他條件一致的情況下，發(fā)射波長365 nm，激發(fā)波長435 nm處的峰響應(yīng)比發(fā)射波長360 nm，激發(fā)波長430 nm 處的峰響應(yīng)更高，見圖1。因此選用發(fā)射波長365 nm，激發(fā)波長435 nm。

圖1 不同波長對(duì)比圖譜

2.1.2 流動(dòng)相選擇

對(duì)比水-（甲醇+乙腈）（70 ∶30）、水-（甲醇+乙腈）（75 ∶25）、水-乙腈（70 ∶30）和水-乙腈（75 ∶25）4 種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)使用水-乙腈、水-（甲醇+乙腈）均能夠有效分離黃曲霉毒素M1。由圖2 可以看出，使用水-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)，峰響應(yīng)要優(yōu)于水-（甲醇+乙腈）的流動(dòng)相體系。水-乙腈（70 ∶30）的流動(dòng)相體系和水-乙腈（75 ∶25）的流動(dòng)相體系可以獲得相似的保留情況，但使用水-乙腈（70 ∶30）作為流動(dòng)相可以獲得更尖銳的峰形，從而提高靈敏度。因此本文選擇使用水-乙腈（70 ∶30）作為流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相對(duì)比圖譜

2.2 方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用質(zhì)量濃度為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)樣分析，以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1在0.051 5 ～5.150 0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，線性方程為Y=4.00×105X-8.74×103，相關(guān)系數(shù)為0.999 867。

2.3 方法的檢出限和定量限

以3 倍基線噪音時(shí)的濃度為檢出限衡量指標(biāo)（S/N≥3），黃曲霉毒素M1在0.02 μg·kg-1濃度添加量的信噪比（S/N）12.06 ＞3。以10 倍基線噪音時(shí)的濃度為定量限衡量指標(biāo)（S/N≥10），黃曲霉毒素M1在0.05 μg·kg-1添加量的信噪比38.62 ＞10。方法的檢出限、定量限符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24——2016）的規(guī)定。

2.4 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品3 組，每組6 份，分低、中、高3 個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)量為0.07 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1，按 照1.4 步 驟 處 理 后 進(jìn)行測定，計(jì)算平行樣品黃曲霉毒素M1測定結(jié)果的回收率和精密度，結(jié)果見表1。《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404——2008）附錄F.1 回收率中規(guī)定被測組分含量＜0.1 mg·kg-1，回收率在60%～120%；附錄F.3 精密度中規(guī)定被測組分含量≤0.1 μg·kg-1時(shí)，變異系數(shù)＜43%，被測組分含量在0.1 ～1.0 μg·kg-1時(shí)變異系數(shù)小于30%[11]。本實(shí)驗(yàn)平均加標(biāo)回收率為81.0%～90.3%，變異系數(shù)為0.72%～3.18%，符合要求。

表1 黃曲霉毒素M1 方法回收率與精密度

2.5 正確度

選用中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評(píng)價(jià)中心的能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測，檢測結(jié)果見表2。由表2 可知，本實(shí)驗(yàn)室與能力驗(yàn)證樣品指定值的檢測偏差為0.36%，說明該方法正確度較好。

表2 黃曲霉毒素M1 正確度

2.6 樣品分析

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》 （GB 2761——2017）中規(guī)定嬰幼兒配方食品黃曲霉毒素M1不得超過0.5 μg·kg-1[12]。隨機(jī)抽取某公司的嬰幼兒配方產(chǎn)品3 批次，使用該方法進(jìn)行黃曲霉毒素M1的測定，結(jié)果均為未檢出（＜0.02 μg·kg-1），檢測結(jié)果符合限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的超高效液相色譜法，結(jié)果表明該方法的檢出限、定量限、回收率、精密度及正確度較好，能夠用于嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的準(zhǔn)確測定。