蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸含量測定的不確定度評定

黃潔潔，王玲玲，邢薇薇

（安徽省食品藥品檢驗研究院（安徽國家農副加工食品質量監督檢驗中心），安徽合肥 230051）

蜂王漿是由工蜂分泌的呈白色或淡黃色漿狀物，含有多種功能因子，其中最受關注的是10-羧基-2-癸烯酸（10-HDA）。10-HDA 是一種不飽和脂肪酸，由工蜂上顎腺分泌[1]，是蜂王漿所特有的高效生物活性物質，因其特殊的藥理和保健作用，受到醫療領域和保健食品領域的廣泛關注[2]。在食品領域，蜂王漿被視為一種天然的保健產品，而10-HDA 是蜂王漿的核心品質指標，《蜂王漿》（GB 9697——2008）根據10-HDA 含量要求分為合格品（含量≥1.4%）和優等品（含量≥1.8%）兩個等級[3]，即10-HDA 含量越高，蜂王漿品質越好。在食品安全監管工作中發現，市售蜂王漿存在摻假摻雜、以次充好現象，品質低劣的產品中10-HDA 含量指標未達“合格線”。為維護食品安全和良好的產品市場秩序，蜂王漿中的10-HDA 含量是國家抽檢蜂王漿類產品的重要監測指標。因而，評價此類產品檢測結果的準確性和科學性有重要意義。

測量不確定度是被測量的客觀值在某一量值范圍內的評定，不確定度的值越小，表示測量的質量越高。其概念在計量基準和標準物質研究中應用廣泛，并滲透到更寬廣的測量分析領域。為了更準確地表達結果和質量評定，本文依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1——2012）[4]，對蜂王漿中的10-HDA 的不確定度進行評定，分析不確定度來源，確保評定結果質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣為某蜂王漿產品。

10-羥基-2-癸烯酸標準品（10-HDA，阿爾塔公司）；無水乙醇（優級純）；對羥基苯甲酸甲酯；甲醇（色譜純）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（島津，配紫外檢測器）；高速離心機；電子天平（梅特勒）。

1.3 樣品前處理

稱取解凍后的樣品0.5 g，加入0.03 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL、水2 mL，渦旋混合后加入無水乙醇 30 mL，加入對羥基苯甲酸甲酯（內標，約0.65 mg·mL-1）10 mL，用無水乙醇稀釋并定容至50 mL，超聲15 min后在3 000 r·min-1下離心10 min，上清液經0.45 μm 濾膜過濾，進樣[3]。

1.4 標準溶液配制

10-HDA 標準儲備溶液配制：精密稱取25 mg10-HDA 標準品，無水乙醇溶解，移入10 mL 容量瓶并定容至刻度，制成濃度為2.5 mg·mL-1的標準儲備液。

10-HDA 標準使用溶液配制：分別吸取10-HDA標準儲備溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL 和 2.0 mL至10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL內標溶液，用乙醇定容至刻度，制成標準測試液。

1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇+水+0.03 mol·L-1鹽酸（55+35+10，v∶v∶v）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：4 μL。

1.6 數學模型

試樣中10-HDA 計算公式為

式中：X為10-HDA 的含量，%；F為校正因子；Ai為試樣溶液中10-HDA 峰面積；As為試樣溶液 中內標物峰面積；ms為內標物質量，g；mi為試樣質量，g。

2 結果與分析

根據檢測過程和數學模型，確定該實驗的不確定度主要來源于標準溶液配制引入、擬合標準曲線引入、試樣制備過程引入和試樣測量重復性引入。

2.1 標準溶液配制引入的相對標準不確定度

2.1.1 標準物質引入的相對不確定度

10-HDA 標準品購自阿爾塔公司，標準物質證書顯示其不確定度為0.5%，采用均勻分布，包含因子k=2，因此，相對標準不確定度為

2.1.2 標準物質稱量引入的相對不確定度

稱量使用的天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.1 mg，假設為均勻分布，稱取標準物質引入的相對標準不確定度為

2.1.3 標準儲備液配制引入的相對不確定度

（1）容量瓶校準引入的相對不確定度。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196——2006）[5]，10 mL A 級容量瓶允差為±0.020 mL，按矩形分布，引入的相對標準不確定度為

（2）溫度引入的相對不確定度。乙醇的膨脹系數為7.5×10-4℃-1，實驗溫度變化范圍為（20±3）℃，按照均勻分布，溫度差異引起的相對標準不確定度為

則標準儲備液配制引入的相對不確定度為

2.1.4 內標物質引入的相對不確定度

在本試驗測定10-HDA 過程中，標準工作液和樣品待測液加入的是同一配制的對羥基苯甲酸甲酯內標液，其純度和配制不影響樣品中10-HDA的含量測定，內標物質引入的不確定度僅由體積產生，因此其不確定度在標準使用液配制過程中 討論[6]。

2.1.5 標準使用液配制引入的相對不確定度

標準使用液配制過程產生的不確定度主要由玻璃量具、移液槍所引入，室溫變化影響因素較小，忽略不計，詳見表1。10 mL A 級容量瓶使用5 次，引入的不確定度同2.1.3。

表1 標準使用液配制過程中移液管、移液槍引入的相對不確定度

由標準使用液配制引入的相對標準不確定度為

綜合上述因素，標準溶液配制引入的相對標準不確定度為

2.2 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度

本試驗采用5 個不同濃度的標準系列工作液進行測量，用HPLC 法測試其峰面積響應值，以10-HDA 溶液與內標溶液的濃度比值為橫坐標x，以10-HDA 溶液與內標溶液的峰面積比值為縱坐標y，線性回歸方程為y=4.349 08x+0.021 97，相關系數R=0.999 9。回歸直線標準偏差按式（2）計算，10-HDA 校準曲線引入的相對不確定度按式（3） 計算。

式中：Ai為擬合工作曲線中各點的標準峰面積與內標物質峰面積的比值；Ci為擬合曲線中各標準點的濃度，μg·mL-1；b為擬合工作曲線的斜率；a為擬合工作曲線的截距；N為擬合曲線中點的個數，N=5；SA為擬合工作曲線的標準偏差；p為樣品的測定次數，p=1；C為樣品濃度，C——為標準系列濃度的平均值，μg·mL-1。

計算得urel(C)=0.005 95，則標準曲線引入的相對標準不確定度為

2.3 試樣制備過程引入的相對標準不確定度

2.3.1 試樣稱量引入的相對標準不確定度

電子天平檢定證書標出的線性誤差為±0.1 mg，假設為均勻分布，樣品稱量引入的相對標準不確定度為

2.3.2 試樣定容體積引入的相對不確定度

50 mL A 級單標線容量瓶允差為±0.05 mL，u(V1)=0.000 58；10 mL A 級單標線吸量管允差為±0.02 mL，u(V2)=0.001 15；2 mL A 級單標線吸量管允差為±0.010 mL，u(V3)=0.002 89。因此，試樣定容體積引入的相對標準不確定度為

綜上，試樣制備過程引入的相對標準不確定度為

2.4 試樣測量重復性引入的相對標準不確定度

同一操作者對蜂王漿中10-HDA 含量進行6 次重復測定，結果分別為1.046%、1.041%、1.034%、1.042%、1.039%和1.046%，平均值為1.0413%，標準偏差S(X)=0.004 6。

2.5 合成不確定度

由上述各相對標準不確定度分量合成蜂王漿中10-HDA 相對標準不確定度為

2.6 擴展不確定度

按照包含因子k=2（置信水平95%），計算出高效液相色譜法測定蜂王漿中10-HDA 含量的相對擴展不確定為urel=k×urel(X)=2×0.019 6=0.032 9，擴展不確定度為U=1.041×0.039 2=0.040 8%。

2.7 測量結果及不確定度的報告

蜂王漿中10-HDA 測定結果可表示為X=（1.041±0.040 8）%，k=2。

3 結論

本文采用HPLC 法測定蜂王漿中10-HDA 含量時，通過不同方面的分析，確定不確定度的來源及不確定度分量，發現主要影響因素為標準溶液配制引入的不確定度以及標準曲線擬合引入的不確定度。依據本研究結果，可通過在測定過程中選用精度較好的量器、規范操作移液管和容量瓶，確保配制標準工作溶液濃度的準確性，通過定期檢定儀器，穩定儀器狀態等方式降低測量的不確 定度。