正交試驗法優選液體發酵云芝糖肽提取工藝條件

李 巖

（廣東嶺南職業技術學院，廣東廣州 510663）

云芝糖肽（Posaverptidum）是從多孔菌科（Polyporaceae）云芝屬（Polystictus）真菌云芝（Coriolus versicolorL.ex.Fr.）（菌株Cov-1）的菌絲體中提取的高分子糖肽聚合物[1-3]，具有補益精氣、健脾養心的功效，對細胞免疫功能和血象有一定的保護作用，可用于食管癌、胃癌及原發性肺癌患者放療、化療所致的氣陰兩虛，已開發為中成藥[4-6]。

目前，云芝糖肽通常采用液體發酵培養，因為液體發酵具有高效生產、萃取工藝簡便、萃取成本低等特點[7-9]。已報道的云芝糖肽的提取方法有水提法、水提醇沉法、酶制劑提取法、超聲提取法和微波提取法等，其中水提醇沉法因操作簡便且安全而被廣泛使用[10]。為提高液體發酵云芝糖肽的提取率，本文以云芝糖肽含量為指標，采用單因素和正交試驗法對液體發酵的云芝進行水提醇沉工藝優化，采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定，從而篩選出高提取率的提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

云芝菌種由本實驗室保存，培養條件為轉速150 r·min-1，溫度28 ℃，裝液量100 mL/250 mL 三角瓶，培養96 h。

1.2 發酵培養基

葡萄糖30 g、玉米粉15 g、豆餅粉20 g、麩皮 7.5 g、磷酸二氫鉀3 g、蛋白胨1 g、硫酸鎂0.2 g，用水定容至1 L，滅菌后4 ℃保存備用。

1.3 儀器與試劑

BSA224S 型電子天平，賽多利斯上海貿易有限公司；CARY 300Conc 型紫外可見分光光度計，美國Varina 公司；BSI-3 型恒溫培養搖床，上海貝茵生物科技有限公司；FSSJG 型高壓滅菌鍋，歐業食品工業裝備（諸城）有限公司；PHSJ-3F 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、硫酸和乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 水提醇沉法提取云芝糖肽單因素試驗

將云芝置于三角瓶中，以云芝糖肽提取率為指標，按照一定料液比加入蒸餾水，經一定溫度水浴提取一定時間后，趁熱抽濾至澄清，濾液濃縮后加入4 倍體積無水乙醇，于4 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心30 min，沉淀即為云芝糖肽。

1.4.2 正交試驗法優化云芝糖肽提取工藝

選取提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數（D）為考察因素，以云芝糖肽提取率為指標進行優化設計，選用L9(34)正交試驗設計表，正交試驗設計因素水平見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表

1.4.3 云芝糖肽含量的測定

參考李巖等[5]的方法采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取時間（30 min、60 min、 90 min、120 min、150 min 和180 min）對云芝糖肽提取率的影響。由表2 可知，隨著提取時間的延長，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取時間超過120 min 后，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩定，不再提高。故水提醇沉法提取云芝糖肽的時間選 擇120 min。

表2 提取時間對云芝糖肽提取率的影響

2.1.2 料液比對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同料液比（10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1和150 g·L-1）對云芝糖肽提取率的影響。由表3 可知，隨著料液比的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當料液比≥100 g·L-1時，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩定，若繼續增大料液比，對后續提取工序增加難度。故水提醇沉法提取云芝糖肽的料液比選擇100 g·L-1。

表3 料液比對云芝糖肽提取率的影響

2.1.3 提取溫度對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取溫度（45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃和95 ℃）對云芝糖肽提取率的影響。由表4 可知，隨著提取溫度的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取溫度超過85 ℃時，云芝糖肽提取率下降。故選擇85 ℃作為最適提取溫度。

表4 提取溫度對云芝糖肽提取率的影響

2.1.4 提取次數對云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取次數（1 次、2 次、3 次和4 次）對云芝糖肽提取率的影響。由表5 可知，隨著提取次數的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當提取次數超過2 次時，云芝糖肽提取率增長情況逐漸趨于平衡，故提取次數選擇2 次。

表5 提取次數對云芝糖肽提取的影響

2.2 正交試驗法優化云芝糖肽提取工藝

根據上述單因素試驗的結果，并綜合考慮各因素經濟成本和效益，以云芝糖肽提取率為試驗指標，采用L9(34)正交試驗設計，分別考察提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數（D）對云芝糖肽提取率的影響，優化水提醇沉法工藝參數，具體結果見表6。由表6 可知，根據極差R值對云芝糖肽提取率的影響排序為提取時間＞料液比＞提取溫度＞提取次數；云芝糖肽的最佳水提醇沉法工藝為A2B3C3D3，即提取時間120 min、液料比150 g·L-1、提取溫度 95 ℃、提取次數3 次。由表7 可知，提取時間對水提醇沉法提取云芝糖肽的提取率有顯著影響 （P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數對其無顯著性影響（P＞0.05）；在最優提取條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝可為功效活性成分云芝糖肽的工業化提取及應用提供技術參考。

表6 正交優化試驗結果

表7 正交優化實驗方差分析

3 結論

本文以云芝糖肽提取率為指標，并采用正交試驗法對液體發酵的云芝進行水提醇沉工藝優化，采用苯酚-硫酸法進行云芝糖肽含量的測定，從而篩選出高提取率的提取方法。結果顯示，水提醇沉法提取云芝糖肽工藝中，提取時間對云芝糖肽提取率具有顯著影響（P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數對其無顯著性影響（P＞0.05）；液體發酵云芝糖肽的最佳水提醇沉提取工藝為提取時間 120 min、 液 料 比150 g·L-1、 提 取 溫 度95 ℃、提取次數3 次，在此條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝為功效成分云芝糖肽的工業化提供 參考。