基于網絡藥理學探討黃芪治療股骨頭缺血性壞死的作用機制*

王明明，程 延

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003)

股骨頭壞死(ischemic necrosis of the femoral head，INFH)是一種臨床常見疾病，多種原因均可導致股骨頭血供出現紊亂，最終引起骨細胞死亡，出現骨小梁斷裂、股骨頭塌陷、骨壞死等為最終結果的髖關節功能減退的一種骨科常見疾病[1]。其分為創傷性和非創傷性，病因多見于創傷、過量飲酒、服用大量激素類藥物、有減壓艙工作史[2]等。根據ONFH中國分期將其分為臨床前期(I期)、早期(Ⅱ期)、塌陷前期(中期，Ⅲ期)、塌陷期(中晚期，Ⅳ期)、骨關節炎期(晚期，Ⅴ期)五期[3-5]。現代醫學認為INFH發病漸進、緩慢，病因與血運障礙、脂質代謝紊亂、骨內壓增高、基因多態性、免疫因素等多種因素有關，但具體發病機制仍不明確，國內提出了包括脂肪代謝紊亂、血管內凝血、血管功能障礙等多種學說，其中靜脈瘀滯、骨內高壓學說普遍為骨科界所接受，該病的最終共同通路是股骨頭的血運損害。這些學說從微觀角度揭示，主要是靜脈回流障礙和骨內壓增高的同時又影響到動脈的血供，造成股骨頭的細胞受壓、壞死，最終導致INFH[6-10]。

股骨頭缺血性壞死的治療主要分為非手術治療、手術治療等兩個方面。根據患者不同的需求，采取不同的治療方案。對于早、中期患者，大多數患者采取非手術治療，以緩解病情進展為原則。中醫對于早中期患者方案多樣，內服中藥是治療INFH的主要形式，以活血化瘀、補腎強骨的藥物為主。輔以其他治療如外用中藥熱敷、針灸、小針刀、推拿按摩以及患肢功能鍛煉等治療，起到延緩、甚至逆轉病情的進展。

黃芪，迄今已有2000多年的藥用歷史，歸脾、肺經，其味甘，性微溫。具有補氣升陽，益衛固表、利水消腫，生津養血，托毒生肌、行滯通痹，斂創生肌的功效[11]。現代藥理學研究表明，黃芪中的黃酮類、多糖類、皂苷類、氨基酸類等均發揮著藥理作用[12]，具有調節機體免疫功能的作用[13]。

本研究是以系統生物學[14]等相關理論，借助網絡藥理學(network pharmacology)方法和計算機相關軟件技術為基礎，探討黃芪的有效成分與相關蛋白靶點之間的互作關系，探索黃芪中多成分、多靶點、多機制、多通路治療股骨頭缺血性壞死的作用機制，為黃芪在臨床治療股骨頭缺血性壞死提供臨床科學依據及應用參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪的有效成分篩選及其靶點獲取 利用中藥系統藥理分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，在Herb name中輸入黃芪(或Huangqi)，檢索黃芪的活性成分，通過相似性(DL)和生物利用度(OB)進行篩選黃芪的高活性成分。經查閱文獻，選擇化合物類藥性(Drug-Like，DL)≧0.18，口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≧30%[15]的化學成分作進一步分析。作為篩選閾值選擇出所需要的高活性的關鍵活性成分，同時將高活性成分所對應的靶點蛋白檢索出來。

1.2 黃芪的高活性成分靶點蛋白規范 由于黃芪的高活性成分靶點來源于不同數據庫，會引起靶點名稱不統一，因此要對篩選出的靶點蛋白要和基因信息進行校正。利用蛋白質數據庫Uniprot(https：//www.uniprot.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數據庫，將1.1所獲得的靶點蛋白在數據庫中進行搜索，選擇已驗證過的“Homo sapiens”，將蛋白質靶點進行校正、規范，獲取標準的靶點名稱。

1.3 股骨頭缺血性壞死靶點及交集靶點的獲取 利用Genecards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(http：//omim.org/)等數據庫，在輸入欄輸入“股骨頭缺血性壞死”英文全稱：Ischemic necrosis of the femoral head，獲得股骨頭缺血性壞死的疾病靶點，去除重復項后并經過Uniprot規范后整理獲得INFH相關疾病靶點，并將其輸出為Excel表格保存。運用R語言(4.1.2版本)系統將獲得的黃芪高活性成分蛋白基因與INFH靶點基因進行韋恩分析，獲取黃芪治療INFH的交集靶點。

1.4 黃芪-活性成分-疾病-疾病靶點基因網絡圖建立 借用Cytoscape3.7.2軟件將黃芪與INFH的交集靶基因與黃芪高活性成分建立黃芪-活性成分-疾病-疾病靶點基因網絡圖，并利用插件NetworkAnalyzer計算相關網絡特征值，以闡明黃芪治療INFH的作用機制。網絡圖中，節點代表高活性成分和靶基因，線代表節點之間相互作用的關系。

2 結果

2.1 篩選出黃芪高活性成分和靶點蛋白 利用TCMSP檢索出953個作用靶點基因，經過口服生物利用度、類藥性篩選后得到20個活性成分和462個作用靶點，其中主要作用成分并經過查閱相關文獻[16-21]包括：含丁子香萜、熊竹素(華良姜素)、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、異鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇 tol、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、聯苯雙酯、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、葉酸、黃芪異黃烷苷、1，7-二羥基-3，9-二甲氧基紫檀烯、槲皮素。利用Uniprot、NCBI等數據庫規范并去重后，獲得相關靶基因197個。其黃芪20個藥效活性成分及OB(%)、DL參數如下：見表1。

表1 黃芪藥效活性成分及對應OB(%)、DL參數

續表1

2.2 INFH疾病的靶點篩選及交集靶點 借用Genecards、OMIM數據庫檢索，去重規范及整合后得到936個靶基因，將2.1所獲得的197個藥物靶基因借用R語言與其計算，共得到69個交集靶點，分別為PGR、NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、ESR2、DPP4、ESR1、PPARg，PPARD、NCOA1、F2、NOS3、XDH、HTR3A、KDR、IL4、SIRT1、HSD3B1、AKT1、BCL2、TNF、MMP1、STAT1、CYP3A4、ICAM1、SELE、VCAM1、INSR、GSTM1、MMP3、EGFR、VEGFA、CCND1、CDKN1A、PLAU、MMP2、MMP9、IL10、RB1、IL6、TP53、NFKBIA、SOD1、ERBB2、MYC、F3、GJA1、IL1B、CCL2、CXCL8、TGFB1、IL2、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNg，PTEN、IL1A、PARP1、PPARA、CRP、CXCL10、SPP1、RUNX2、IGF2、CD40Lg，RASA1。交集Venny圖可視化見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點基因Venny圖

2.3 建立中藥-活性成分-疾病-疾病靶點基因網絡圖 借用Cytoscape3.7.2軟件構建黃芪、活性成分及INFH疾病靶點基因之間的相互作用關系，將其相互之間的聯系進行可視化，建立黃芪-活性成分-疾病靶點基因網絡可視圖，圖中左邊粉色為中藥，即黃芪，中間綠色為黃芪高活性成分，淺綠色為疾病，即INFH，紫色和紅色代表所有靶基因，單獨紅色代表黃芪-INFH共同靶基因(即黃芪治療INFH作用靶基因)，線代表中藥、活性成分、疾病及靶點之間的相關性。通過插件cytoNCA按著度degree、緊密度closeness兩種屬性分別取排序靠前的成分有：常春藤皂苷元、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、槲皮素等。如圖2。

2.4 蛋白質PPI相互作用網絡圖的構建 將黃芪-疾病交集靶點基因導入到STRING數據庫進行蛋白互作分析，篩選出分值在0.9以上的蛋白互作關系，構建蛋白(PPI)互作關系網絡圖。共有69個節點、202條邊，平均節點度為5.86，平均局部聚類系數是0.537，圖中的“邊”代表靶基因之間的聯系，“邊”的粗細表示：邊越粗，相互之間的結合度就越大，combine score值就越大；其中作用靶基因用節點表示。見圖3。經過分析發現，分值為0.99或以上的互作蛋白有56對：AKT1-NOS3、AR-NCOA1、CCND1-CDKN1A、CCND1-ESR1、CDKN1A-TP53、EGFR-RASA1、ESR1-NCOA1、ESR2-NCOA1、F2-THBD、KDR-VEGFA、NCOA1-PPARg，NCOA1-PPARA、PLAT-SERPINE1、PLAU-SERPINE1、PTEN-TP53、SIRT1-TP53、AR-CCND1、CCND1-RB1、CXCL8-IL1B、EGFR-ERBB2、ESR1-NOS3、PPARG-SIRT1、CXCL8-IL6、IL1B-IL6、EGFR-ESR1、EGFR-STAT1、ESR1-RUNX2、IL10-TNF、NCOA1-PGR、BCL2-TP53、CCL2-CXCL8、IL10-IL1B、IL1A-IL1B、CCL2-IL6、CXCL8-IL10、ESR1-TP53、IL6-TNF、PPARA-SIRT1、PTGS2-TP53、AKT1-CDKN1A、CCL2-IL1B、IL1A-IL6、IL4-TNF、AKT1-PTEN、CCL2-TNF、CXCL8-TNF、NFKBIA-TNF、RB1-RUNX2、CCL2-CXCL10、CCND1-MYC、F2-F3、IL4-IL6、MMP9-TGFB1、IL1B-IL4、IL6-TGFB1、RB1-TP53，這些靶點蛋白之間的相互作用關系極其重要。

圖3 黃芪潛在治療靶基因的互作關系網絡圖

借用Cytoscape3.7.2軟件，將黃芪潛在治療INFH疾病靶基因互作關系Degree值進行可視化，其中Degree值越大，代表黃芪作用于此靶基因的作用越大，即圖中形狀越大，反之則小。其中Degree值較大的靶基因為：IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1。見圖4。

圖4 黃芪潛在治療靶基因互作關系Degree可視化圖

利用插件計算每個基因節點的連接個數，繪制Degree排列靠前的35個靶基因進行可視化展示，構建PPI核心基因條形圖，見圖5。

圖5 PPI核心基因條形圖

2.5 GO富集分析 借用DAVID數據庫將黃芪-INFH交集靶點進行GO功能富集分析，包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)，經過P≤0.05進行規范篩選后，共富集到GO條目426項，其中BP、CC、MF分別為347、23、56項。表明中藥黃芪可通過多項BP、CC、MF治療INFH，BP、CC、MF分別前10項富集分析結果的條形圖和氣泡圖詳見圖6。(圖中條形長度表示富集的基因個數，條形顏色代表分類，氣泡圖顏色代表富集的程度，氣泡的大小代表富集的基因個數)

圖6 黃芪治療股骨頭缺血性壞死GO富集分析條形圖和氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 將黃芪-INFH交集靶點進行KEGG通路富集分析，并借用String數據庫進行規范校正，篩選P值≤0.05的條目，共富集到78條信號通路，將其按照P值大小由小到大進行排列，將排列前20名的通路繪制成條狀圖和氣泡圖，見圖7。

圖7 KEGG通路富集分析條形圖和氣泡圖

3 討論

近年來，由于外傷、激素與酒精應用不當，股骨頭缺血性壞死患者逐年增多[22]。據流行病學調查研究顯示國內股骨頭患者高達約800萬例[23]。祖國醫學將其隸屬于“骨痹”“骨痿”及“骨蝕”的范疇，早期病因以氣滯血瘀為多，屬“髖骨痹”的范疇；而中期以骨枯筋軟為特征，屬于“骨痿”的范疇；晚期股骨頭出現塌陷和軟骨損傷，多屬于“骨蝕”的范疇[24]。本病病機以本虛標實多見，肝腎虧虛為本虛，氣滯、痰濁、血瘀為標實[25]，并將其致病因素歸納為虛、痰、瘀[26]。有研究表明，黃芪中芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類、及黃芪甲苷等皂苷類具有改善微循環的作用[27]。本研究從藥物-疾病Venny網絡圖可知，黃芪中刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、槲皮素、異鼠李素等20個化合物作用于INFH疾病相關的69個靶點，進一步證明了黃芪是通過多成分、多靶點共同協作治療INFH。

PPI互作關系網絡圖是靶點之間相互作用的可視化體現，靶點之間的相互作用，構成了復雜的生物網絡體系，其中連接度越大，表明黃芪通過此靶點治療股骨頭缺血性壞死的可能性越大。通過PPI篩選可知IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等可能是黃芪治療INFH的關鍵靶點。相關研究發現，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種多功能、多效應及多向性的細胞因子[28]。是一種可溶性介質，對炎癥、免疫反應和造血功能、骨代謝具有多重作用[29]。在炎性疾病中如類風濕性關節炎，IL-6的持續表達可以增強破骨細胞的形成、分化及間接影響成骨細胞凋亡[30-31]。Kamiya，N等[32]研究指出IL-6是股骨頭壞死活躍期滑膜中存在的特異性炎性細胞因子。Yamaguchi等[33]學者也指出關節軟骨細胞產生的IL-6是由于HIF-1α的激活，刺激了滑膜細胞的炎癥反應，并認為缺氧關節軟骨細胞產生的IL-6刺激滑膜細胞增殖和炎性細胞因子反應，其機制可能是缺血性骨壞死的誘導通過HIF-1信號傳導途徑導致關節軟骨中的IL-6活化。并提出阻斷IL-6是治療缺血性骨壞死后滑膜炎的前景治療方法。通過PPI網絡分析，采用cytoHubba 插件計算出黃芪作用于IL6的連接度最大，極有可能說明黃芪可通過抑制IL6等促炎性因子進而治療INFH疾病。

通過GO富集分析預測出，黃芪治療INFH的BP作用機制可能是通過RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、基因表達的正向調節(positive regulation of gene expression)、蛋白質磷酸化的正向調控(positive regulation of protein phosphorylation)、藥物反應(Response to drug)、炎癥反應(inflammatory response)、負調控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)通過細胞外隙(extracellular space)、細胞外區(extracellular region)、酶結合(Enzyme binding)、蛋白結合(Protein binding)產生治療作用的。

依據KEGG通路富集分析結果可知，預測出黃芪治療INFH疾病的治療通路，其治療過程中相關度較高的治療通路可能與膀胱癌(Bladder cancer)、瘧疾(Malaria)、癌癥(Pathway in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等。從富集分析得到的結果來看，說明黃芪的活性成分所對應的核心靶點映射在不同的通路上，是通過多條通路共同發揮藥效，進一步表明了其研究機制。

綜上所述，黃芪治療INFH的作用機制可能是其有效活性成分通過IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等關鍵靶基因通過調控膀胱癌、瘧疾、癌癥、乙型肝炎、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等互相介導而產生抑制炎癥、提高免疫和神經遞質，從而調控機體改善股骨頭壞死的癥狀。通過調控RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調控、基因表達的正向調節、蛋白質磷酸化的正向調控、藥物反應、炎癥反應、負調控凋亡過程等和通過膀胱癌、瘧疾、癌癥、乙型肝炎、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等多條相關信號通路共同協作治療INFH疾病的作用。本研究通過網絡藥理學方法揭示了黃芪有效成分、靶基因、通路之間的相互協作關系，發現黃芪治療INFH是通過多成分、多靶點、多通路的作用機制，進而驗證了黃芪治療INFH是通過多途徑、多方面產生抑制炎癥、提高免疫和神經遞質的作用機制，體現了中醫藥治療疾病的整體觀念。進一步為黃芪治療股骨頭壞死的臨床應用提供了更為嚴謹的理論基礎。