超高效液相色譜-串聯質譜法測定調味料中嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿殘留量

張哲，張瑩，趙桐，趙靈智，沈晶萍，王世琨，李思圓

(吉林農業大學 生命科學學院，長春 130118)

罌粟殼中含有嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因等生物堿，因其具有鎮靜、止痛、成癮、損害神經系統等特性被列為毒品，嚴禁將其添加到食品中。由于火鍋底料中添加罌粟殼會使火鍋味道更美、口感更足，食用后容易上癮，有些不良商家將罌粟殼加入火鍋調料中以吸引回頭客來牟取利益[1]。國家早在2008年印發了《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，規定火鍋中不得違法添加罌粟殼，2011年又將禁用的食品類別擴大到火鍋底料及小吃。歷年發布的《國家食品安全抽檢實施細則》中更是明確將嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因列為餐飲食品自制火鍋調味料(底料、蘸料)的日常監測項目。

目前食品中罌粟殼成分的檢測方法主要有氣相色譜法[2]、液相色譜法、氣相色譜/質譜法、液相色譜-質譜/質譜法。其中液相色譜-質譜/質譜法因具有分辨率高、靈敏度高、檢測限低，定性、定量準確，可進行痕量分析等特點，已被市場監管總局指定為檢測食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的補充檢驗方法，成為檢測罌粟殼類生物堿的主要方法[3-4]。在色譜柱選擇上，由于嗎啡等生物堿極性大，在普通C18反相柱上保留時間短、峰形差，達不到較好的分離效果[5]，大多采用BEH HILIC色譜柱進行檢測[6-10]。然而HILIC柱為正向色譜柱，使用溶劑有限，只能使用70%以上乙腈，難以預平衡，且價格昂貴、使用壽命短，實驗室普及率不高[11-12]。在樣品前處理上，QuEChERS凈化法操作簡單，但凈化效果不理想，且對嗎啡等有強吸附，回收率低[13-16]，常采用陽離子交換固相萃取凈化法[17-18]，而陽離子交換固相萃取柱除油脂效果不理想，操作較繁瑣，且容易發生小柱堵塞現象[19-20]，無法實現批量檢測。

本試驗采用實驗室常用的Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?反相色譜柱分離，建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定調味料中罌粟殼類生物堿，嗎啡等5種生物堿得到了很好的色譜保留和分離，且峰形對稱；在樣品處理上，樣品經乙腈提取、鹽析、低溫高速離心后，將提取液氮吹近干，用10%乙腈溶液(含0.1%甲酸)溶解殘渣后，再經低溫高速離心、過膜除去樣品中干擾物，獲得了理想的凈化、回收效果，使樣品前處理過程更加簡便，適合大批量的日常分析檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

調味料：固態火鍋底料、半固態米線調味醬、半固態小龍蝦調味醬、湯料共4種，購于超市。

自制火鍋調味料(蘸料)：海鮮汁、沙茶醬、孜然油、麻油、辣椒油、芝麻油共6種，購于火鍋店。

1.2 試劑

甲醇中嗎啡標準溶液(M-005-1ML，濃度1 mg/mL)、甲醇中可待因標準溶液(C-006-1ML，濃度1 mg/mL)、甲醇中蒂巴因標準溶液(T-115-1ML，濃度1 mg/mL)、甲醇中嗎啡-D3標準溶液(M-006-1ML，濃度1 mg/mL)、甲醇中可待因-D3標準溶液(C-007-1ML，濃度1 mg/mL)：Cerilliant；鹽酸罌粟堿標準物質(純度99.9%，CCHM700898)、那可丁標準物質(純度97%，CCHM700909)：CATO Research Chemicals Inc.；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：Fisher Scientific公司；甲酸(色譜純)：上海安譜實驗科技股份有限公司；無水乙酸鈉(分析純)：天津市致遠化學試劑有限公司；無水硫酸鎂(分析純)：北京邁瑞達科技有限公司；0.1%甲酸-水溶液(體積比)；0.1%甲酸-甲醇溶液(體積比)；10%乙腈-水溶液(含0.1%甲酸)；針頭過濾器(0.2 μm，13 mm)：Pall Corporation。

1.3 主要儀器與設備

API4000+超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(ESI離子源) 美國AB SCIEX公司；Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?色譜柱(100 mm×3.0 mm) 美國Phenomenex公司；渦旋混合器(重載數顯型) 美國Talboys公司；KQ-500DE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；TTL-DC氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司。

1.4 液相色譜-質譜/質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?(100 mm×3.0 mm)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：A相為 0.1%甲酸-水(體積比)，B相為0.1%甲酸-甲醇(體積比)。流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phases and gradient elution conditions

1.4.2 質譜條件

離子源：ESI；掃描方式：正離子模式,多反應監測(MRM)；離子源參數：電噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化氣壓力(GS1)：55 psi；輔助氣壓力(GS2)：60 psi；氣簾氣壓力(CUR)：30 psi；離子源溫度(TEM)：550 ℃；噴撞氣(CAD)：10 mL/min。監測離子對、碰撞氣能量和去簇電壓參數見表2。

表2 監測離子對、碰撞氣能量和去簇電壓參數 Table 2 Monitoring ion pair,collision gas energy and declustering potential parameters

1.5 標準溶液配制

1.5.1 標準儲備液配制

精密稱取罌粟堿、那可丁標準品各10 mg(精確至0.01 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，加0.5%甲酸-甲醇溶液溶解并定容至刻度，罌粟堿、那可丁濃度各1.0 mg/mL。嗎啡、可待因、蒂巴因、嗎啡-D3、可待因-D3均為購置現成的標準溶液，其濃度均為1.0 mg/mL。

1.5.2 混合標準溶液配制

準確吸取嗎啡、可待因標準儲備液各100 μL，蒂巴因標準儲備液20 μL，那可丁、罌粟堿標準儲備液各10 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容于10 mL。配制的混合標準溶液中嗎啡、可待因濃度為10 μg/mL，蒂巴因濃度為2 μg/mL，那可丁、罌粟堿濃度為1 μg/mL。

1.5.3 混合標準使用液配制

準確吸取混合標準溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容至刻度。配制的混合標準使用液中嗎啡、可待因濃度為100 ng/mL，蒂巴因濃度為20 ng/mL，那可丁、罌粟堿濃度為10 ng/mL。

1.5.4 混合內標溶液配制

準確吸取嗎啡-D3、可待因-D3標準儲備液各10 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容于10 mL。配制的混合內標溶液的濃度均為1 μg/mL。

1.5.5 混合內標工作液配制

準確吸取混合內標溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用20%乙腈水溶液定容至刻度。配制的混合內標工作液的濃度均為100 ng/mL。

1.5.6 混合標準工作溶液系列配制

分別準確吸取混合標準使用液5，10，20，50，100，200 μL于6個樣品瓶中，各加入100 ng/mL混合內標工作液50 μL，用10%乙腈-水溶液(含0.1%甲酸)定容至1.0 mL，混勻。配制的混合標準工作溶液系列中嗎啡、可待因濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL；蒂巴因濃度分別為0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，4.0 ng/mL；那可丁、罌粟堿濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ng/mL。此混合標準工作溶液中內標濃度均為5.0 ng/mL。

1.6 樣品處理

稱取1.50 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入1 μg/mL混合內標溶液75 μL，固體樣品加3 mL水，半固體樣品加2 mL水，液體樣品不加水，渦旋振蕩30 s，準確加入乙腈15 mL，渦旋1 min，超聲提取30 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉粉末，立即渦旋振蕩2 min，吸附樣品中的全部水分，以9 500 r/min離心5 min(4 ℃)，準確吸取1.0 mL上清液于10 mL濃縮管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，準確加入1.0 mL 10%乙腈溶液(含0.1%甲酸)溶解殘渣，渦旋1 min，超聲2 min，再渦旋1 min后，將溶液轉移至1.5 mL離心管中，以9 500 r/min離心5 min(4 ℃)，上清液過0.22 μm濾膜后，進行超高效液相色譜-串聯質譜測定。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

以0.1%甲酸-水-0.1%甲酸-乙腈為流動相，考察了Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?(100 mm×3.0 mm)和Kinetex?2.6 μm F5 100 ?(50 mm×3.0 mm)兩款反相色譜柱對嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿的分離效果，結果：在Kinetex?2.6 μm F5 100 ?色譜柱上，嗎啡岀峰快，保留時間短，峰形較寬、不對稱，響應值低，且5種生物堿各離子對的離子比不穩定(見圖1)，可見此款反相色譜柱不是首選柱，這與文獻[5]、文獻[20]的研究結果一致；而在Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?色譜柱上，嗎啡等5種生物堿均有合適的保留時間和令人滿意的峰形，且響應值增高(見圖2)。分析原因：Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?柱是一款核-殼聯苯基色譜柱，這種由核-殼顆粒帶來的高性能配合獨特的固定相，可以實現反相保留以及增強極性與芳香類化合物的選擇性，且能顯著改善色譜峰形，提高靈敏度，其色譜分離相互作用機理：由聯苯基雙環結構所產生的高密度電子云可起到類似弱陽離子交換的作用，使得堿性分析物的保留增強。

圖1 Kinetex? 2.6 μm F5 100 ?柱-混合標準工作溶液總離子流色譜圖Fig.1 The total ion current chromatogram of Kinetex? 2.6 μm F5 100 ? column-mixed standard working solution

圖2 Kinetex? 2.6 μm Biphenyl 100 ?柱-混合標準工作溶液總離子流色譜圖Fig.2 The total ion current chromatogram of Kinetex? 2.6 μm Biphenyl 100 ? column-mixed standard working solution

2.2 流動相的選擇

在Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?色譜柱(100 mm×3.0 mm)上分離，分別以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈，0.1%甲酸-水(含10 mmol/L甲酸銨)和0.1%甲酸-乙腈，0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-甲醇為流動相，按表1中梯度程序洗脫，考察3種流動相對嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿的分離效果，結果表明，以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈為流動相，那可丁和罌粟堿兩色譜峰重合(見圖2)，在0.1%甲酸-水中加入10 mmol/L甲酸銨后，那可丁和罌粟堿兩峰不但沒有分開，5種生物堿的響應值反而下降。改用0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-甲醇為流動相，5種生物堿均得到了良好的色譜分離，各離子對的離子比更穩定，且嗎啡、可待因的響應值顯著提高(見圖3)，故選用0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-甲醇為流動相。

圖3 5種生物堿混合標準工作溶液的總離子流色譜圖Fig.3 The total ion current chromatogram of mixed standard working solution of five kinds of alkaloids

2.3 質譜條件優化

根據5種生物堿的化學性質，采用電噴霧電離正離子模式掃描。針泵進樣100 ng/mL標準溶液，5種生物堿離子化時均得到[M+H]+分子離子作為母離子。調節碰撞氣能量(CE)值，將母離子進一步碰碎，分別選擇響應值較高的兩個子離子，按多反應監測(MRM)組建監測離子對，用Ramp進一步優化碰撞氣能量CE和去簇電壓DP參數(見表2)。設定離子源參數和液相色譜參數，進樣分析混合標準工作溶液，驗證所選擇的離子對的響應值和穩定性滿足檢測要求。5種生物堿混合標準工作溶液的多反應監測(MRM)色譜圖見圖4。

圖4 5種生物堿混合標準工作溶液的多反應監測(MRM)色譜圖Fig.4 Multi-reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed standard working solution of five kinds of alkaloids

2.4 前處理方法優化

文獻中，樣品提取后主要有兩種凈化方法：一是QuEChERS試劑凈化，二是陽離子交換固相萃取凈化。QuEChERS凈化法操作簡單，但回收率低，而陽離子交換固相萃取凈化法操作較繁瑣，且容易堵塞小柱。本文在BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》方法的基礎上進行了改進，固體樣品加3 mL水，半固體樣品加2 mL水，液體樣品不加水，加乙腈15 mL超聲提取，保證樣液中乙腈含量大于80%，可有效沉淀蛋白質，加入無水醋酸鈉促進生物堿從水相轉移至有機相，并用無水硫酸鎂去除水相，在4 ℃下9 500 r/min高速離心，有效分層去除蛋白質、油脂等雜質。吸取1 mL乙腈提取液氮吹近干，加1 mL 10%乙腈溶液(含0.1%甲酸)溶解殘渣，進行溶劑轉換，再在4 ℃下9 500 r/min高速離心、過膜，目的是進一步去除有機物雜質來凈化樣液。同時，用10%乙腈溶液(含0.1%甲酸)溶解樣液，可以避免出現溶劑效應而導致嗎啡、可待因峰形展寬，響應值降低的情況發生。結果表明，5種生物堿的回收率均達75%以上。

2.5 方法的校準曲線和檢出限

按本文優化的色譜質譜條件，對混合標準工作溶液系列進行測定，以嗎啡、可待因的峰面積與相應內標物峰面積的比值為縱坐標，嗎啡、可待因的濃度與相應內標物濃度的比值為橫坐標，繪制內標-標準工作曲線；以蒂巴因、那可丁、罌粟堿的峰面積為縱坐標，蒂巴因、那可丁、罌粟堿的濃度為橫坐標，繪制外標-標準工作曲線，回歸方程和相關系數見表3。結果表明，嗎啡、可待因在0.50～20.0 ng/mL，蒂巴因在0.10～4.0 ng/mL，那可丁、罌粟堿在0.05～2.0 ng/mL范圍內均有良好的線性關系，相關系數r均大于0.998。另外，在半固態調味醬空白樣品中加入低濃度混合標準工作液，制備加標樣品，按本文方法進行提取測定并計算其信噪比，以3倍信噪比(S/N=3)對應的加標量為最低檢出限。由嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁、罌粟堿的信噪比圖(見圖5～圖9)可知,嗎啡、可待因的方法檢出限為1.0 μg/kg，蒂巴因的方法檢出限為0.2 μg/kg，那可丁、罌粟堿的方法檢出限為0.1 μg/kg。該方法檢出限低，適用于調味料中嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿的痕量分析。

表3 標準曲線的回歸分析和方法檢出限Table 3 Regression analysis and method detection limits of standard curves

圖5 嗎啡定量離子對286.0/165.1的信噪比圖(加標量1.0 μg/kg)Fig.5 The signal to noise ratio diagram of morphine quantitative ion pair 286.0/165.1 (with adding standard matter amount of 1.0 μg/kg)

圖6 可待因定量離子對300.0/215.1的信噪比圖(加標量1.0 μg/kg)Fig.6 The signal to noise ratio diagram of codeine quantitative ion pair 300.0/215.1(with adding standard matter amount of 1.0 μg/kg)

圖7 蒂巴因定量離子對312.0/58.2的信噪比圖(加標量0.2 μg/kg)Fig.7 The signal to noise ratio diagram of thebaine quantitative ion pair 312.0/58.2(with adding standard matter amount of 0.2 μg/kg)

圖8 那可丁定量離子對414.2/220.2的信噪比圖(加標量0.1 μg/kg)Fig.8 The signal to noise ratio diagram of narcotine quantitative ion pair 414.2/220.2(with adding standard matter amount of 0.1 μg/kg)

圖9 罌粟堿定量離子對340.2/202.1的信噪比圖(加標量0.1 μg/kg)Fig.9 The signal to noise ratio diagram of papaverine quantitative ion pair 340.2/202.1(with adding standard matter amount of 0.1 μg/kg)

2.6 方法的精密度和加標回收率

分別選取固態、半固態、液態調味料為空白樣品(檢測結果均為陰性)，分別按5，10，20倍檢出限3個濃度水平加入5種生物堿混合標準使用液，制備加標樣品，對每個添加水平重復測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差，數據見表4。結果表明，嗎啡回收率在76.6%～117.3%范圍內，相對標準偏差在11.9%～14.4%之間；可待因的回收率在84.4%～111.4%范圍內，相對標準偏差在4.2%～14.1%之間；蒂巴因的回收率在85.1%～111.5%范圍內，相對標準偏差在2.7%～7.1%之間；那可丁的回收率在75.2%～103.6%范圍內，相對標準偏差在2.6%～7.2%之間；罌粟堿的回收率在83.0%～106.0%范圍內，相對標準偏差在1.9%～5.3%之間，滿足GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中附錄F對精密度、回收率的要求，說明該方法準確、穩定、可靠。

續 表

2.7 樣品測定

實驗共選取10種調味料進行了檢測，其中固態火鍋底料、半固態米線調味醬、半固態小龍蝦調味醬、湯料共4種預包裝調味料購于超市；海鮮汁、沙茶醬、孜然油、麻油、辣椒油、芝麻油共6種自制火鍋調味料(蘸料)購于火鍋店，均未檢測出嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁、罌粟堿，說明目前該類市售調味料質量狀況良好，結果令人滿意。

3 結論

本試驗采用實驗室常用的Kinetex?2.6 μm Biphenyl 100 ?反相色譜柱，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定調味料中罌粟殼類生物堿，嗎啡等5種生物堿均得到了很好的色譜保留和分離，降低了方法檢出限；在樣品處理上進行了改進，獲得了理想的凈化、回收效果，使樣品前處理過程更加簡便。該方法檢出限在0.1～1.0 μg/kg之間，加標回收率在75.2%～117.3%范圍內，相對標準偏差均小于15%，具有較高的靈敏度、準確度和重現性，可用于調味料中嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿的痕量分析，且該方法更容易推廣應用。