黑皮雞樅菌多糖提取工藝及抗氧化活性研究

陳灼娟，周倩，楊志強

(1.福州大學至誠學院 食品與生物工程系，福州 350102；2.福建省食品藥品質量檢驗研究院，福州 350011)

真菌多糖是從真菌中分離出來的由10個分子以上單糖通過糖苷鍵連接的高分子聚合物。真菌多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、調節血糖[4]、抗病毒[5]、抑菌[6]等生物活性。目前已有上百種真菌多糖被分離并研制成調味品、藥品或保健品。真菌多糖可以制成丸劑、湯劑、針劑、沖劑、片劑、膠囊、糖漿乃至飲品、速溶茶、酒飲料等產品。真菌多糖產品具有廣闊的開發前景。

黑皮雞樅菌是一種藥食兩用的珍貴食用菌，其多糖含量高于一般食用菌[7-9]，是一種良好的提取材料。食用菌多糖提取有水提法、酸堿浸提法、酶解法、超聲波法、超臨界流體萃取法、微波法等[10]。其中酶解法具有條件溫和、易控制、時間短、提取率高以及對多糖結構損害較小等優點[11]。采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶組成復合酶，去除纖維素、蛋白質及果膠等成分，利于多糖溶出[12]，輔助超聲波技術，促進物質的擴散和溶解，增強提取效果[13-14]。采用超聲波輔助復合酶提取黑皮雞樅菌多糖，優化多糖提取工藝，并對提取物的抗氧化活性進行測定，可以為黑皮雞樅菌多糖產品的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑皮雞樅菌干品：產于云南。

1.2 試劑

硫酸、苯酚、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、過氧化氫：均為分析純，西隴科學股份有限公司；抗壞血酸(分析純)：天津市北辰區方正試劑廠；水楊酸(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；DPPH(分析純)：上海麥克林化工有限公司；纖維素酶(10 U/mg)：生物純，羅恩試劑；果膠酶(500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)：均為生物純，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設備

UV-5200紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司；3K15臺式冷凍離心機 德國西格瑪公司；DK-S26恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；FE28 Standard酸度計 美國梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ5200DE臺式超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 多糖提取的工藝流程

將黑皮雞樅菌子實體干燥至恒重，用粉碎機粉碎后過40目篩備用。精確稱取1.00 g黑皮雞樅菌子實體粉末置于三角瓶中，加入30 mL超純水攪拌均勻，于90 ℃水浴中浸脹1 h，溫度迅速降至室溫，制成黑皮雞樅菌粉溶液。稱取質量分數為2%的復合酶，加入黑皮雞樅菌粉溶液，在50 ℃、pH 5.5的條件下，酶解120 min。酶解結束后，將酶解液pH調節至7，迅速升溫至90 ℃滅酶10 min。將上述酶解液置于超聲波儀中，在60 W、50 ℃條件下，超聲處理20 min。酶解液離心取上清液，加入4倍體積無水乙醇沉淀靜置過夜，在5 000 r/min條件下，離心10 min，取沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2次，干燥后得黑皮雞樅菌粗多糖。

1.4.2 多糖提取率的計算

黑皮雞樅菌粗多糖用蒸餾水溶解，利用苯酚硫酸法測定多糖含量[15]，計算多糖的提取率。以葡萄糖含量Y(μg)為縱坐標，吸光值A為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得線性方程Y=123.19A，相關系數R2=0.998。取2.0 mL黑皮雞樅菌多糖溶液進行適當稀釋，用相同方法顯色測吸光值A，代入方程計算多糖含量，求出多糖提取率。

1.4.3 多糖提取單因素試驗

按照“1.4.1”提取黑皮雞樅菌多糖。固定其他因素，分別以酶的比例(纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶為1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)、酶的添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、pH(4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)、酶解溫度(30，40，50，60，70 ℃)和酶解時間(30，60，90，120，150 min)為單因素，考察這些因素對黑皮雞樅菌多糖提取率的影響，試驗重復3次，試驗結果取平均值。

1.4.4 多糖提取響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇液料比、酶解溫度和酶解時間3個因素，采用Design-Expert 8.0.5 軟件設計三因素三水平的BBD試驗[16]，試驗因素與水平設計見表1，以多糖提取率為指標，確定最優的提取條件，在實際條件下進行驗證試驗。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.4.5 黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性分析

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力測定[17]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮雞樅菌多糖溶液與0.02 mmol/L DPPH-乙醇溶液。2.0 mL不同濃度的多糖溶液分別與2.0 mL DPPH-乙醇溶液充分混合后，避光反應30 min，測定517 nm處的吸光值A1。用相同體積無水乙醇替代DPPH-乙醇溶液，測定吸光值A2。用相同體積超純水替代多糖溶液，測定吸光值A0。DPPH自由基清除率按照公式(1)計算。同時以相同方法測定不同濃度的抗壞血酸(VC)的自由基清除率，作為陽性對照。試驗重復3次，取平均值作為最終的試驗結果。

(1)

1.4.5.2 羥自由基清除能力測定[18]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮雞樅菌多糖溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。準確量取FeSO4溶液、乙醇-水楊酸溶液、多糖溶液各1.0 mL，混合均勻后，加入1.0 mL H2O2溶液，在37 ℃水浴中反應15 min，測定510 nm處的吸光值A1。用蒸餾水代替H2O2，測吸光值A2。用蒸餾水代替多糖溶液，測吸光值A0。同時以相同方法測定不同濃度的抗壞血酸(VC)的自由基清除率，作為陽性對照。試驗重復3次，取平均值作為最終的試驗結果。

(2)

2 結果與分析

2.1 多糖提取試驗優化

2.1.1 多糖提取單因素試驗結果及分析

2.1.1.1 復合酶比例對多糖提取率的影響

纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶按一定質量比(1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)加入黑皮雞樅菌粉溶液，按照“1.4.1”的方法進行酶解，研究不同復合酶比例對多糖提取率的影響。由圖1可知，不同復合酶比例下提取效果差異較大。子實體多糖存在于細胞壁內，復合酶能使與多糖結合的纖維素、果膠、蛋白質等不同程度分離溶出。增加纖維素酶的比例，可使多糖提取率顯著增加，當纖維素在復合酶中的比例為40%時，提取率較高，再增加纖維素酶的比例至80%，提取率大大降低。當纖維素酶占比為40%時，果膠酶∶木瓜蛋白酶為1∶1時，多糖提取率最高。綜合試驗結果，選擇纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為4∶3∶3進行后續試驗。

圖1 復合酶比例對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.2 液料比對多糖提取率的影響

不同液料比條件下多糖提取率見圖2，經單因素方差分析，得到液料比對多糖提取率有極顯著影響(P<0.001)。液料比由10∶1梯度增加到40∶1時，多糖提取率從5.33%逐步增加到13.29%，繼續升高液料比至50∶1，多糖提取率下降。增加液料比，可以促進多糖的溶出，提高提取率[19]。但液料比過高，底物濃度下降，酶解效果降低，同時溶液過稀，稀釋了超聲波對物料的空化作用，導致多糖提取率下降[20]，液體使用量過多，也會增加后期純化成本[21]。因此，選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1進行后續響應面優化分析。

圖2 液料比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.3 復合酶添加量對多糖提取率的影響

由圖3可知，復合酶添加量從1.0%增加到2.5%時，多糖提取率從11.26%增加到16.71%，這是因為隨著復合酶的增多，食用菌細胞壁發生了降解，有利于多糖溶出[22]。酶添加量繼續增加至3.0%時，多糖提取率略有升高，但增幅不明顯。酶的使用量在一定程度上決定了酶解時間和提取率，加入的酶太少，底物無法充分酶解。當酶量充足時，增加酶量對提取率的影響不大，綜合試驗成本考慮，選擇3.0%的復合酶添加量，酶添加量因素不進行后續的響應面優化分析。

圖3 復合酶添加量對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of complex enzyme addition amount on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.4 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖4可知，酶解溫度由30 ℃上升到60 ℃時，多糖提取率從9.79%增加至15.16%，達到最大值。隨后酶解溫度繼續提高，多糖提取率出現下降趨勢。酶解溫度是復合酶提取法中較為重要的一個因素，在一定的適宜溫度內，酶解溫度既能影響酶的活力，也會影響物質的溶解度[23]，溫度太高可能導致酶活力下降[24]，同時破壞多糖原有的活性和結構，而使酶解效率和酶解速率降低[25]。經單因素方差分析，得到酶解溫度對多糖提取率有極顯著影響(P<0.001)。因此，選擇50，60，70 ℃進行后續的響應面優化分析。

圖4 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.5 酶解pH對多糖提取率的影響

由圖5可知，不同酶解pH下的多糖提取率在13.58%～14.58%范圍內，變化不大。酶解pH是酶解反應中重要的影響因素之一，不同的酶最適pH有所不同，pH過高或者過低都會影響酶的活性，同時影響多糖的溶出效應[26]。本研究試驗結果顯示，pH對酶解提取率的影響不大，可能是由于復合酶中的纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最適pH不同，在不同pH條件下此消彼長。經單因素方差分析，得到酶解pH對多糖提取率的影響不顯著(P>0.05)。綜合提取率和試驗成本考慮，選擇pH 7.5作為酶解條件，pH因素不進行后續的響應面優化分析。

圖5 酶解pH對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis pH on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.6 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖6可知，酶解時間從30 min增加到90 min，多糖提取率緩慢升高到最大值16.22%，繼續延長酶解時間至150 min，多糖提取率下降。經單因素方差分析，得到酶解時間對多糖提取率有極顯著的影響(P<0.001)。酶解時間過短，導致酶解反應不夠充分，使得多糖不能有效浸提，而時間過長又會因為多糖可能水解，導致提取率下降[27]。綜合考慮，選擇酶解時間60，90，120 min進行后續的響應面優化分析。

圖6 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 響應面分析及優化

響應面試驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

續 表

利用Design-Expert 8.0.5對表2中的試驗數據進行多項擬合回歸分析，得到黑皮雞樅菌多糖提取率Y(%)對液料比A(mL/g)、酶解溫度B(℃)、酶解時間C(min)的二次項多元回歸方程：Y(%)=-88.54+1.51A+2.19B+0.34C-9.75×10-4AB-2.02×10-3AC+1.26×10-3BC-1.49×10-2A2-2.14×10-2B2-2.11×10-3C2。

由表3方差分析結果可知，該模型的P<0.01，說明模型極顯著，失擬項不顯著，校正模型R2=0.945 4，RAdj2=0.875 3，說明模型與實際結果擬合較好。液料比(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)對多糖提取率的影響極顯著。由F值可知，3個因素對多糖提取率影響的主次順序為溫度(B)>液料比(A)>酶解時間(C)。表3中交互項AB、BC及AC的P值均大于0.05，圖7中兩因素交互作用的響應面底部等高線接近圓形，說明這3個因素的交互作用不顯著。

表3 響應面設計回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model of Box-Behnken design

圖7 因素交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface diagrams of interactive effects of factors

2.1.3 提取參數及驗證試驗

采用Design-Expert 8.0.5軟件分析，得到黑皮雞樅菌多糖提取的最佳工藝條件為液料比47.50∶1(mL/g)、酶解溫度54.24 ℃、酶解時間73.51 min，在該條件下預測提取率為19.14%。根據實際情況調整最佳提取工藝為液料比47∶1(mL/g)、酶解溫度54 ℃、酶解時間73 min，在此條件下進行3次重復性驗證試驗，得到多糖提取率3次平均值為18.75%，相對誤差為2.08%，實測值與預測值擬合度較好。

2.2 黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

以相同濃度的VC溶液為陽性對照，黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除能力測定結果見圖8。

圖8 黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由圖8可知，黑皮雞樅菌多糖樣品溶液濃度在0.5～4.0 mg/mL范圍內，DPPH自由基清除率隨多糖樣品溶液濃度的增加而升高。當黑皮雞樅菌多糖溶液濃度為4.0 mg/mL時，黑皮雞樅菌多糖自由基清除率為93.44%，表現出較強的自由基清除能力。

2.2.2 水楊酸法測羥基自由基清除率

以相同濃度的VC為陽性對照，黑皮雞樅菌多糖的體外羥基自由基清除率測定結果見圖9。

圖9 黑皮雞樅菌多糖的羥基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由圖9可知，當黑皮雞樅菌多糖樣品溶液濃度由0.5 mg/mL增加至4.0 mg/mL時，多糖的清除率緩慢上升，具有較好的線性關系。當多糖濃度為4.0 mg/mL時，羥基自由基清除率為47.58%，與相同濃度的VC相比清除能力稍差。

3 結果與討論

單因素試驗結合響應面試驗得到黑皮雞樅菌多糖的最佳提取條件為纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶4∶3∶3、復合酶添加量3.0 %、液料比47∶1(mL/g)、酶解溫度54 ℃、酶解時間73 min、酶解pH 7.5，在該條件下，多糖的提取率達到18.75%，優于常見的水提法、醇提法。測定黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率，結果表明4.0 mg/mL 的黑皮雞樅菌多糖對DPPH自由基清除率為93.44%，對羥基自由基清除率為47.58%，且自由基清除能力與濃度呈明顯的效應關系，說明超聲波輔助復合酶提取法能夠保留黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性。該方法提取的黑皮雞樅菌多糖可以作為天然抗氧化劑，應用于食品、藥物、保健品等領域。真菌多糖具有毒副作用小、藥理作用多樣等特點[28]，特別是在抗氧化方面，后期可以對其體內抗氧化活性進行研究，為其進一步開發利用提供理論依據。該方法提取的黑皮雞樅菌多糖是否具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌等生物學活性有待進一步研究。

真菌多糖最常見的提取方法為水提法，其原理是利用多糖易溶于水的特性進行提取，方法操作簡單，但是耗時長且提取率不高，若在較高溫度下反復操作，會降低多糖結構的穩定性[29]。本研究利用纖維酶、果膠酶及蛋白酶共同作用于黑皮雞樅菌子實體細胞壁，減少傳質阻力，操作簡單，條件溫和，不破壞多糖結構，輔助超聲波提取技術，利用超聲波的空化作用、機械振動、乳化效應等，加速多糖溶出，使多糖提取率高于常見的提取方法，該方法對今后的試驗研究具有一定的借鑒作用。