微波消解ICP-MS法對活血止痛軟膠囊、片、膠囊中30種重金屬及無機元素分析

曹 玉 史 達 陳 潔,2 張 玲,2*

1.南京市食品藥品監督檢驗院，江蘇 南京 210000；2.南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 211166

活血止痛膠囊、活血止痛片、活血止痛軟膠囊均由當歸、三七、乳香(制)、冰片、土鱉蟲、煅自然銅6味藥組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效，用于跌打損傷、瘀血腫痛[1]，臨床多用于治療急、慢性軟組織損傷類疾病。制劑中自然銅為礦物藥，存在伴生的重金屬及有害元素殘留風險，其中Pb、Hg、As、Cd、Cu是普遍存在的毒重金屬，研究[2-4]表明Pb在人體內的清除速率較慢，長期低劑量接觸對人體肝、腎、骨骼、神經系統都會產生危害。目前自然銅的執行標準《中華人民共和國藥典》2020年版(以下簡稱《中國藥典》2020版)一部未對重金屬進行控制，活血止痛制劑中僅膠囊劑《中國藥典》2020年版執行標準收載了Pb、As、Hg三種重金屬及有害元素限度控制。活血止痛片執行標準(國家食品藥品監督管理局國家藥品標準YBZ01112005-2009Z、YBZ25062005-2010Z、YBZ25142005-2009Z、YBZ30222005-2009Z等)及軟膠囊《中國藥典》2020年版執行標準均未對上述重金屬元素進行控制。

本研究參照《中國藥典》2020年版、美國藥典15種重金屬元素限度[5-6]、《ICH Q3D元素雜質指導原則》[7]中原料輔料元素相關限度規定，通過電感耦合等離子體質譜法對活血止痛制劑的Pb、Hg、As、Cd、Cu等毒重金屬檢驗，對比國際相關無機元素限度標準，深入研究其涵蓋的無機元素含量[8]，同時對制劑中存在的多種人體有益無機元素分析，進一步明確活血止痛口服制劑質量安全及藥效量化元素基礎，為合理評價含自然銅礦物藥活血止痛口服制劑質量提供參考價值。

1 儀器與試劑

Agilent 7900 ICP-MS儀；CPA225D 十萬分之一電子天平 (Sartorius 公司)，Milli-Q 純水儀(默克公司)；MARS 6型微波消解儀(美國CEM公司)；聚四氟乙烯微波消解管(CEM)。

多元素標準混合溶液[Ag、Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Se、Sr、Tl、V、Zn,質量濃度：100 μg/mL；唯一標識：21D60453]；[Au、Hf、Ir、Pd、Rh、Ru、Sb、Sn、Te,質量濃度：100 μg/mL；唯一標識：21D60005]；單元素標準混合溶液[Mg，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：206034-5；Na，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：1906024-7；Os，質量濃度：100 μg/mL；唯一標識：21D4200；K，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：206033-4；Hg，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：20A038-7；Pb，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：20C002-6；Ca，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：203049-8；Ni，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：21D50216；Fe，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：214038-6；Cu，質量濃度：1000 μg/mL；唯一標識：20C013-3];內標標準混合溶液[Bi、Ge、In，質量濃度：10.0 μg/mL；唯一標識：21D81077]。以上均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。硝酸(優級純，Fisher Chemical)，水為超純水(Milli-Q制備)。

活血止痛膠囊47批，活血止痛軟膠囊7批，活血止痛片29批，均為市售。來源為南京中山制藥有限公司、湖北惠海希康制藥有限公司、江蘇萬高藥業股份有限公司等8家生產企業。

2 方法與結果

2.1 儀器條件 射頻功率：1550 W；采集模式：質譜圖；峰形：3點；重復次數3次,掃描/重復時間100次；穩定時間：10 s；分辨率：標準；蠕動泵轉速：0.3 r/s；樣品引入時間：20 s；穩定時間：20 s；采樣深度：8.0 mm；霧化氣：1.09 L/min；霧化室溫度：2 ℃；氦氣流量：4.5 mL/min。

2.2 微波消解條件 采用程序升溫，在600 W下，5 min內升溫至120 ℃，維持5 min；相同功率下，4 min鐘內再次升溫至160 ℃，維持5 min；3 min內升溫至180 ℃，維持30 min；待程序結束后，冷卻至60 ℃以下，取出消解罐。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標準儲備液 精密吸取兩種多元素標準混合溶液(100 μg/mL)及Os單元素標準溶液(100 μg/mL)、Ni單元素標準混合溶液(1000 μg/mL)、Pb單元素標準混合溶液(1000 μg/mL)適量，加2%硝酸至50 mL量瓶中，制得10 μg/mL儲備液；精密吸取K、Ca、Na、Mg、Al各單元素標準溶液1 mL至50 mL量瓶中，制得200 μg/mL儲備液；精密吸取Hg單元素標準溶液(1000 μg/mL)、Fe單元素標準溶液(1000 μg/mL)適量，2%硝酸稀釋分別制得100 ng/mL、160 μg/mL標準儲備液。

2.3.2 系列混合標準溶液 分別精密吸取上述單元素、多元素標準儲備液適量，加2%硝酸分別制成含K、Ca、Na、Mg、Al 0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，含Fe 0.8 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL，含Hg 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，含其他元素0.5 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL的系列混合標準溶液，臨用新制。

2.3.3 混合內標溶液 精密吸取Ge、In 、Bi標準混合溶液適量，加入2%硝酸制成Ge、In 、Bi混合標準溶液100 ng/mL，臨用新制，Ge、In 、Bi不同內標矯正代表性ICP-MS線性圖如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 內標Ge校正代表元素Cu、Zn、As線性關系圖

圖2 內標In校正代表元素Ru、Rh、Pd線性關系圖

圖3 內標Bi矯正代表元素Hg、Tl、Pb線性關系圖

2.3.4 供試品溶液的制備 精密稱取活血止痛樣品約0.5 g，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸8 mL，加蓋，于室溫下預消解過夜，置于微波消解儀中按照“2.2”項下方法消解，待消解完全并冷卻至60 ℃以下后取出，緩慢擰開消解罐，將微波消解罐置于趕酸儀中，加熱至紅棕色氣體揮盡，放至室溫，轉入50 mL量瓶中，少量水洗滌消化罐5次，合并洗滌液至量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，另精密吸取0.5 mL上清液，2%硝酸溶液稀釋至10 mL量瓶刻度。若供試品元素濃度不在線性范圍內調整稀釋倍數進樣分析，同法制備試劑空白溶液。

2.4 測定方法 采用在線內標法，以蠕動泵將樣品與混合內標溶液混合后，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄響應值分別對系列混合標準溶液及供試品溶液、空白溶液分析，以內標校正的標準曲線法計算各元素的含量。

2.5 線性關系考察 取“2.3.2”項下系列混合標準溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，保持內標管在儀器工作狀態中始終插入混合內標溶液，依次將樣品管引入系列混合標準溶液中，記錄響應值。以各待測元素質量濃度為橫坐標(X)、各待測元素與內標響應值的比值為縱坐標(Y)，分別繪制標準曲線。各單元素標準溶液線性關系見表1。

表1 線性關系、檢出限和定量限

2.6 檢測限和定量限考察 在同等試驗條件下，重復測定2%硝酸溶液11次，以測定結果標準偏差(SD)的3.3倍除以各元素標準曲線的斜率，所得結果即為各元素的檢測限，以測定結果標準偏差(SD)的10倍除以各元素標準曲線的斜率，所得結果即為各元素的定量限。見表1。

2.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下各混合標準溶液及單元素標準溶液，按“2.1”項下方法平行測定6次，記錄響應值。結果Hg元素響應值RSD為3.5%，其余各元素響應值RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取同一樣品(批號：200405)6份，按照“2.3.4”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下方法測定，由內標校正的標準曲線計算樣品中各元素的含量及RSD。由于部分元素(Ru、Rh 、Pd 、Ag、 Sn、 Sb、 Te 、Os、 Ir 、Pt)濃度低于檢測限，因此元素重復性以回收率RSD值表示。結果見表2。

表2 回收率和重復性考察結果 (n=6)

2.9 穩定性試驗 取加樣回收樣品(批號：200606)，在8 h內等時間間隔連續測定10次，以各元素測定值計算RSD, Hg元素RSD為5.4%，其余各元素的RSD%均小于3.0%，提示供試品制備后應及時檢測，減小不穩定元素測定偏差。

2.10 加樣回收率試驗 取供試品制備項下一半量已知元素含量活血止痛膠囊(批號：190605)、片劑(批號：200405)、軟膠囊(批號：200606)，精密稱定，各6份，置微波消解罐中，精密加入Fe單元素標準溶液(1000 μg/mL) 0.4 mL，Hg單元素標準溶液(1 μg/mL)0.6 mL，K、Ca、Na、Mg、Al混合標準儲備液(20 μg/mL)2 mL，多元素混合標準儲備液(10 μg/mL)0.5 mL，按“2.3.4”項下方法處理，定容至50 mL，稀釋后依法測定記錄響應值并計算回收率。結果見表2。

2.11 樣品含量測定 按照擬定方法，測定活血止痛膠囊47批，活血止痛軟膠囊7批，活血止痛片29批次中30種元素的殘留量。擬定限度參考《中國藥典》2020版、USP 41-NF 36和ICH Q3D相關標準。每批次樣品平行雙樣。結果見表3。

表3 樣品測定結果 (n=2)

3 討論

3.1 無機元素研究基礎概述 據已有研究[9]報道，無機元素常見分析手段包括紫外-可見分光光度法(UV)、原子熒光光譜法(AFS)[10]、原子吸收光譜法(AAS)[11]、電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)[12-13]、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[14]等。與以上分析技術比較，ICP-MS具有線性范圍寬、靈敏度高、干擾少、多種重金屬元素同時分析等優點，更適合中藥復方制劑中無機元素的檢測，本實驗在此基礎上研究分析該制劑多種重金屬及有害元素，為合理評價含礦物藥自然銅中成藥活血止痛制劑質量提供參考價值。

3.2 待測元素的選擇及樣品預處理 《中國藥典》2020年版四部通則“9302 中藥有害殘留物限量制定指導原則”明確指出重金屬及有害元素為Pb、Hg、As、Cd、Cu等；美國藥典列出15種重金屬控制元素限度，《ICH Q3D元素雜質指導原則》對元素雜質分類：將Cd、Pb、As、Hg列為第一類元素，將Co、V、Ni、Tl、Au、Pd、Ir、Os、Rh、Ru、Se、Ag、Pt列為第二類元素，將Li、Sb、Ba、Mo、Cu、Sn、Cr列為第三類元素進行限度控制，因此擬定對以上涵蓋24種重金屬及K、Ca、Na、Mg、Al、Fe等高含量無機元素檢測分析。

與微波消解比較，傳統的干法灰化和濕法消解存在消解不完全、揮發元素易損失問題，影響結果的精密度與準確度。因此實驗中采用高溫高壓密閉微波消解法預處理樣品，經趕酸后得到澄清透明液體，使消解完全。趕酸時由于As、Hg等揮發性元素的存在，因此控制趕酸溫度在110 ℃，溫度不宜過高。另制劑中含有礦物藥自然銅重金屬含量異常高，制備供試品溶液時選擇適當稀釋倍數稀釋進樣以避免儀器的污染。

3.3 元素含量分析 根據《中國藥典》2020年版對活血止痛膠囊Pb、Hg、As的限度規定，明確其中Pb≤60 mg/kg、Hg≤12 mg/kg、As≤300 mg/kg。47批膠囊劑Pb、Hg、As均符合藥典限度；照《中國藥典》2020年版該膠囊劑重金屬限度要求，軟膠囊Pb、Hg、As符合以上限度；而29批次片劑中6批次Pb超出以上限度，Hg、As含量符合藥典限度。

現行國家藥典標準，對元素Cd、Cu等未規定其含量限度，制劑中Cd元素含量較低，最高濃度小于4 μg/g，但其中Cu元素普遍含量較高，其中39批次膠囊劑、6批次片劑其Cu元素均高于美國藥典口服濃度限度100 μg/g；砷(As)、鈷(Co)、釩(V)、鎳(Ni)、鉈(Tl)、鋇(Ba)、鉬(Mo)等元素一定程度超出《ICH Q3D元素雜質指導原則》元素限度。以上中藥有害殘留物限量指導原則控制的Pb、Hg、As、Cd、Cu 有害元素中，發現活血止痛片劑存在重金屬Pb超出膠囊劑藥典限度標準及部分制劑Cu元素遠高于國際相關標準現象，提示該制劑中存在重金屬超限及用藥風險隱患。

除Pb、Hg、As、Cd、Cu有害重金屬外，制劑中其他人體所需元素Fe、K、Mg、Ca等含量顯著高于其他無機元素, 已明確其在參與骨骼代謝、治療跌打損傷中發揮著顯著作用[15-16]。其中Fe元素主要來源于煅自然銅，是合成血紅蛋白、肌紅蛋白、鐵蛋白的必需原料，Cu元素以金屬酶形式存在于酶活性部位，提高賴氨酰氧化酶活性，Mg在提高堿性磷酸酶(ALP)活性促進骨細胞增殖發揮著重要作用[17-19]，共同為活血止痛制劑發揮活血散瘀功效提供療效基礎。

以上研究表明，活血止痛制劑中存在活血止痛片重金屬含量限度標準缺失，同時片劑中重金屬Pb含量高于藥典膠囊劑擬定限度，部分重金屬超出國際標準現象。而中藥制劑組成復雜，不能單一參考國外標準評價制劑質量，如Cu元素既是骨骼生長必需元素同時又存在重金屬蓄積的風險，ICH Q3D或美國藥典元素限度并不適合中藥制劑，因此建立中藥材與中藥制劑元素范圍較廣的元素限量標準具有十分重要的研究意義。

本研究采用微波消解ICP-MS法建立同時測定活血止痛制劑中30種元素方法，同時對比《中國藥典》2020年版，USP 41-NF 36和《ICH Q3D元素雜質指導原則》國際相關限度標準，為活血止痛質量研究，對擬定合理元素限度保證此類中藥口服制劑安全性、有效性提供數據支撐及技術參考價值。