TCF7L2及經典Wnt信號通路在肝癌中作用的研究進展

姚寶樂 朱曉娟 溫望文 戴偉 劉圣蘭 黃浩

贛南醫學院，贛州 341000

肝癌（LC）是最為常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其最常見的類型。HCC的致病因素包括病毒感染、過度酒精攝入以及非酒精性肝炎等。目前，病毒性和酒精性肝癌正逐漸減少，而非酒精肝炎誘發的肝癌逐年升高，這已成為全球性公共衛生問題。肝癌發生隱匿，不易診斷，確切診斷肝癌經常是該病的晚期，這是預防和治療肝癌的關鍵障礙之一。因此，尋找有效的肝癌早期標志分子迫在眉睫。

轉錄因子7 樣2（transcription factor 7 like 2，TCF7L2）又稱淋巴細胞因子4，其位于染色體10q25.2-q25.3。TCF7L2 屬于TCF 家族蛋白，是該家族蛋白最常見的亞型，同時也是經典Wnt 信號通路的關鍵成員，其轉錄功能的激活依賴于分子伴侶β 連環蛋白（β-catenin）（基因名CTNNB1）。TCF7L2 參與細胞增殖、分化和凋亡等多個進程，對維持正常機體環境中個體的發育具有重要作用。

在肝組織中，Wnt 信號通路調控肝癌細胞代謝。TCF7L2 是經典Wnt 信號通路的關鍵成員，其在調控肝細胞表型中具有重要作用。研究表明，TCF7L2 與肝組織的代謝及肝癌細胞代謝具有密切關聯，敲低肝細胞的TCF7L2可引起肝細胞氨基酸、脂以及糖代謝相關基因的差異表達［1］。此外，肝組織TCF7L2 的表達水平與肝腫瘤的形成呈正相關［2］，且TCF7L2 的敲除可以終止肝腫瘤形成［3］。高表達的TCF7L2 能夠促進糖酵解、抑制糖異生進而形成有利于肝癌細胞生存的環境［3］。對于糖尿病患者，TCF7L2 誘導胰島素抵抗，造成糖代謝及脂代謝紊亂，提高肝臟的癌性病變風險［2］。因此，TCF7L2與肝癌的發生具有密切聯系。

TCF7L2 存在于機體的不同組織中，其單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）及轉錄剪切后形式的信使RNA（mRNA）造成了該蛋白在不同器官和疾病中的功能差異，系統性認知TCF7L2對提供新的肝癌早期診斷靶標具有關鍵作用。本文就TCF7L2 及經典的Wnt 信號通路在肝癌中特異性作用展開綜述。

TCF7L2的基因結構

TCF7L2 基因的組成分為基本結構和可變域。TCF7L2 基因結構可以劃分為編碼β-catenin 結合的結構域的編碼序列、高遷移率族（high mobility group，HMG）DNA 結合的結構域編碼序列、依賴背景的可變結合的結構域編碼序列以及可變性剪切的C 末端編碼序列。TCF7L2 轉錄本由基因序列和剪切模式共同調節，可變性剪切的C 末端依賴不同的剪切模式形成差異的TCF7L2轉錄本［4］。

在人類的基因組中，TCF7L2 包含17 個外顯子，其中接近C 末端及C 末端區域的外顯子13～16是常規剪切區域但不是固定剪切域，不同組織和疾病的外顯子剪切區存在差異［4］。

外顯子1、2、3、5、7～15 和17 編碼596 個氨基酸，而外顯子4 編碼的23 個氨基酸形成的蛋白結構域功能仍屬未知［5］。外顯子1 編碼直接作用于β-catenin 的蛋白結構域，而外顯子5 編碼的蛋白磷酸化則具有抑制TCF7L2 活性的作用，外顯子9 前段和外顯子10 末端編碼結構域可直接分別結合TLE 家族蛋白及Groucho 家族蛋白［6］，這兩者均能夠抑制β-catenin 對TCF7L2 的功能激活。外顯子11 和12 是編碼形成HMG 結構域的基因序列，HMG 結構域是TCF7L2 轉錄因子的DNA 結合區［7］。外顯子13 的前端是編碼核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）結構域的關鍵序列，TCF7L2 易位細胞核依賴于NLS 的導向作用。終止密碼子區位于C 端，包含外顯子15～17。未經剪切的終止密碼子區經剪切產生短、中、長不同長度的終止密碼子區，其中短終止密碼區包含外顯子15 和16，中密碼子區包含外顯子15、16 和外顯子17 部分序列，長密碼子區包含外顯子15、16和17［8］。終止密碼子區的長度改變TCF7L2開放閱讀框序列長度，影響TCF7L2蛋白形成。依賴細胞背景剪切產生的豐富TCF7L2 轉錄本是造成該蛋白豐富功能核心要素之一。

TCF7L2作為診斷肝癌的標志分子

各類型肝損傷是引發肝癌的重要驅動因素。對于肝硬化患者，位于TCF7L2 基因的3＇末端SNPs（rs290481、rs290487 和rs290489）與患HCC 風險存在明顯的正相關［9］。長期非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFLD）具有肝癌病變風險，TCF7L2 的多態性與NAFLD 的出現高度相關［10］。糖尿病是發展HCC的獨立風險因子，TCF7L2在糖尿病向HCC 的進展中可能具有驅動作用［11］，這與TCF7L2 調控紊亂的肝細胞糖代謝具有密切聯系。TCF7L2 可誘導小鼠胰島素瘤細胞MIN6的胰島素分泌，進一步研究揭示肝癌細胞中的TCF7L2 通過激活胰島素信號通路pAKT∕pGSK 從而提高細胞的糖代謝能力，促進肝癌細胞的存活［12］。含三模體71（tripartite motif containing 71，TRIM71）控制肝癌細胞的生長［13］，在肝癌細胞HepG2 中，交聯RNA 免疫共沉淀（crosslinked RNA immunoprecipitation，CL-RIP）測序揭示TRIM71 富集的RNA 片段中具有TCF7L2 mRNA。這表明TCF7L2 可能具有誘導肝癌發生的作用［14］。通過對比人癌旁組織和人肝癌組織的TCF7L2 轉錄水平，發現高表達TCF7L2 mRNA 與肝腫瘤發生、進展以及轉移具有緊密聯系［15］。

過表達TCF7L2促肝腫瘤生成活性

一氧化氮是經典的抗氧化因子。肝癌細胞的一氧化氮合酶2的啟動子區域包含結合TCF7L2的淋巴細胞因子4結合元件1 和淋巴細胞因子4 結合元件2［16］，這為肝癌細胞的生存提供了有利的抗氧化環境。微粒體前列腺素E 合酶-1（microsomal prostaglandin E synthase-1，mPGES-1）誘導肝癌的發生，源自mPGES-1 的PGE2 促進肝癌細胞β-catenin∕TCF7L2 復合體形成［17］。研究發現，在肝癌細胞株HuH6、Hep3B、HepG2 和HLE 中，TCF7L2 mRNA 呈現高水平狀態［18］。長鏈非編碼RNA 轉移相關肺腺癌轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是肝癌中的促癌基因，MALAT1 正向調控TCF7L2的5＇-非翻譯區從而提高TCF7L2 mRNA水平［3］。由于多種剪切方式，TCF7L2 存在多個差異的轉錄本，這直接導致了TCF7L2蛋白異構體對肝癌影響的差異。例如，正常肝組織中廣泛存在TCF7L2-B，該異構體缺乏外顯子4、SxxSS、C-clamp和羧基末端結合區域，而結合翻譯這些結構域的蛋白是TCF7L2的直接抑制因子。另有研究指出，缺乏外顯子4 的TCF7L2 具有明顯更高的促肝癌生成效應［16］；類似地，缺乏SxxSS 的TCF7L2-C 和TCF7L2-J 更加活躍，其顯著激活Wnt 信號通路促進肝癌細胞的增殖且TCF7L2-J 比TCF7L2-K 具有更高的促腫瘤生成活性。與肝癌患者的癌旁組織相比，過表達TCF7L2-J 的肝癌組織與AXIS 抑制蛋白2、Wnt1誘導信號通道蛋白2 和基質金屬蛋白酶7 等促肝癌發生因子的高表達具有顯著正相關［19］。綜上所述，TCF7L2的異常高表達可促進肝癌發生及發展。

TCF7L2誘導肝癌細胞增殖和侵襲

近年諸多研究表明，腫瘤干細胞是組織癌變的更深層內在因素。高遷移率族A1（high mobility group AT-hook 1，HMGA1）對維持惡性腫瘤干細胞狀態具有關鍵作用。成人肝祖細胞（adult hepatic progenitor cells，AHPC）存在激活狀態的Wnt∕β-catenin 信號，可激活HMGA1 表達，其對腫瘤干細胞的增殖活性具有重要效應［20］。研究表明，驅動蛋白家族成員C1（kinesin family member C1，KIFC1）在肝癌細胞中存在高表達，可促進HMGA1 基因轉錄，進而增強促侵襲因子信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），MMP2 和上皮間質轉化相關基因等基因表達［21］。體內外試驗均證明TCF7L2 激活KIFC1，增強HMGA1 表達，促進HCC 細胞增殖和侵襲，降低HCC 對抗癌藥物紫杉醇的敏感度［22］。炎癥是HCC 發展的驅動要素，G 蛋白α 亞基（G-protein alpha subunit，GNAS）激活突變可形成罕見的炎性肝腫瘤亞組。體外試驗中，STAT3 直接作用活化GNAS 進而促進LPS 刺激的HCC 細胞生長和侵襲［23］。前叉箱G1 蛋白（forkhead box G1，FOXG1）是Fox轉錄因子家族的成員，參與多種癌癥的轉移調控。研究發現，FOXG1 通過激活Wnt∕β-catenin 信號促進肝癌細胞的轉移［24］。miR-139 靶向抑制TCF7L2 而作為抑制肝癌細胞增殖和侵襲的治療因子［25］。因此，TCF7L2對肝癌細胞的增殖和擴散具有驅動作用。

經典Wnt信號通路

經典Wnt信號通路是一個復雜的信號分子網絡。在該信號被激活時，細胞分泌的Wnt 配體結合細胞膜的卷曲受體（frizzled，Fzd）、低密度脂蛋白受體相關蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein 5∕6，LRP5∕6）和散亂蛋白（dishevelled，Dvl）受體家族，而激活的受體由腺瘤性結腸息肉蛋白、Axin、糖原合酶激酶3 和酪蛋白激酶1 等組合的蛋白復合物降解。Wnt 信號通路被抑制時，該復合物協同β-轉導重復相容蛋白（β-transducin repeat containing protein，β-TrCP）促進β-catenin 降解。Wnt信號通路被激活時，Dvl 等受體的激活促進胞漿β-catenin 從復合體釋放和活化。β-catenin 易位至核內后，協同其他分子伴侶激活核內TCF家族蛋白的轉錄功能。

依賴TCF7L2的經典Wnt信號通路調節肝功能

TCF7L2 的功能依賴于蛋白的結構以及相關作用轉錄因子的共同調節。在經典的Wnt 信號通路中，TCF7L2 的HMG 結構域結合包含5＇（A∕T）（A∕T）CAAAG3＇基因序列的DNA，這表明TCF7L2 蛋白在經典Wnt信號通路中是作為轉錄因子。TCF7L2 的轉錄活性依賴β-catenin 的直接結合而激活，而TCF7L2 調節的Wnt∕β-catenin 信號通路功能依賴于背景環境，但是該通路在肝組織及肝細胞中具有雙向調節作用。尤其，經典Wnt∕β-catenin 信號在肝再生和肝腫瘤發生中的協調機制則尚未明確。

1.依賴TCF7L2 的經典Wnt 信號通路在肝發育及肝再生中作用

β-catenin∕TCF7L2 是Wnt 信號通路的效應體。在胚胎期，Wnt 信號通路的阻斷顯著促進早期胚胎的致死率。肝源于胚胎的前腸內胚層，Wnt 信號通路對前腸內胚層的發育具有關鍵作用。在分子伴侶肝細胞核因子1β、叉頭框蛋白A1、叉頭框蛋白A2和GATA 結合蛋白4共激活下，Wnt信號通路驅動前腸內胚層向肝的特異性發育［26］。體外試驗表明，β-catenin也誘導肝細胞的增殖、分化以及成熟。另有研究發現，在肝切除術（PHx）模型中，β-catenin 在短時間內出現明顯增高，對促進肝細胞增殖因子表達具有重要作用［8］。在PHx 模型中，肝細胞Wnt 共受體LRP5∕6 的敲除導致小鼠肝再生延遲［26］。在肝再生的早期階段，任何肝損傷都可引起竇狀內皮細胞和巨噬細胞釋放Wnt 配體，Wnt 配體通過旁分泌至肝細胞Fzd 和LRP5∕6 的共受體上，誘導β-catenin易位核中，核β-catenin 與TCF 家族蛋白相互作用誘導包括細胞周期蛋白D1 等的表達，最終促進肝細胞增殖。在成熟的健康肝中，Wnt∕β-catenin信號通路通常是抑制狀態，但肝細胞更新和肝細胞再生能夠激活該通路［27］。

2.TCF7L2介導的經典Wnt信號通路的異常激活誘導肝癌的發生

AHPC 是肝臟中的兼性干細胞，參與多種肝疾病的發生。研究發現，AHPC陽性的肝組織具有更高的肝癌病變風險［28］。肝損傷伴隨著肝母細胞和AHPC 細胞的激活，在潛在的致癌物作用下，這兩種干細胞在肝組織的持續增殖是引起肝腫瘤的重要內因。在損傷后再生的肝組織中，維持β-catenin 的活化可引起AHPC 細胞群的聚集和擴散［28］?？缒さ鞍?（transmembrane protein 9，TMEM9）是APC 的抑制因子，損傷的肝細胞會出現明顯的TMEM9 高表達，而APC的下調引起β-catenin 入核，這維持Wnt 激活狀態，提高肝細胞向肝癌細胞轉變的風險。在HCC 和膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）中，Wnt∕β-catenin 信號被高度激活并促進腫瘤生長和傳播［29］。肝母細胞瘤是最常見的小兒肝癌，也是β-catenin激活導致的常見結果。

相比較正常組織，缺血性再灌注導致肝癌組織肝癌細胞具有更高的凋亡率［30］。敲除細胞β-catenin 的小鼠對肝臟缺血和再灌注損傷更為易感，因為β-catenin 可通過與缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF-1α）結合緩解缺氧對肝臟的損傷［31］。事實上，β-catenin∕HIF-1α 復合體被證實對缺氧的肝癌細胞具有保護效應［32］，這進一步明確了β-catenin對肝癌發生的誘發作用。

研究發現，利用轉基因技術同時過表達人β-catenin 和斑馬魚TCF7L2 的斑馬魚出現嚴重的肝腫大［19］。持續性肝炎可進展成肝硬化，肝硬化存在很大概率漸變成肝癌［33］。研究指出，Wnt∕β-catenin 的激活與肝纖維化存在密切的正相關性［33］。利用CBP∕β-catenin 結合抑制劑PRI-724，可阻止β-catenin 的活化對TCF 蛋白的轉導激活，進而防止肝硬化［33］。β-catenin 具有K335、W383 和N387 等多個形式的變異體，具有促肝腫瘤生成的作用，且都具備TCF 家族蛋白的結合位點［34］。轉錄終止因子-1 相互作用蛋白5（transcription termination factor I-interacting protein 5，TIP5）已被證實可顯著激活TCF7L2∕β-catenin 信號通路而發揮促HCC 作用［35］。因此，TCF7L2∕β-catenin 調控的經典Wnt信號通路對肝癌的發生具有推動作用。

結語與展望

TCF7L2 是經典Wnt∕β-catenin 信號通路的轉錄因子，β-catenin 結合并活化TCF7L2，被激活的TCF7L2 直接決定了該通路產生的效應。通常情況下，處于非增殖期的健康肝細胞的β-catenin 功能處于抑制狀態，因此TCF7L2 未被活化。異?；罨腡CF7L2 依賴促進下游肝損傷因子及肝癌誘導因子的表達提供適于肝癌細胞生成的內環境。在肝癌細胞中，TCF7L2 促進細胞的增殖和侵襲，導致癌癥發展。TCF7L2 的功能依賴于背景環境，不同的組織或細胞內環境對其基因序列和基因剪切體形式有較大影響，活躍的TCF7L2 結構域是其驅動肝損傷及肝癌的重要支撐。綜上所述，TCF7L2可能是肝癌診斷及治療的潛在重要靶點。