以腸道菌群為靶點(diǎn)治療原發(fā)性膽汁性膽管炎的臨床應(yīng)用

馬銘涵， 劉彥琦

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化科， 呼和浩特 010050

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelia cell，BEC)為特征性靶標(biāo)的具有器官特異性的自身免疫相關(guān)肝病?，F(xiàn)今全球多個(gè)國(guó)家及地區(qū)的流行病學(xué)分析均顯示其患病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。雖然PBC屬于自身免疫性疾病，但免疫抑制劑、生物制劑暫未發(fā)現(xiàn)明顯效益[2]，對(duì)失代償或嚴(yán)重頑固瘙癢的患者，根本上改善生存率的方法只有肝移植(LT)[3]?！凹膊∧c治”是近年研究熱點(diǎn)，研究人員從微生態(tài)角度出發(fā)，以腸道菌群為靶點(diǎn)，探究未來是否可通過重塑腸道微環(huán)境，干預(yù)PBC疾病進(jìn)展。

1 PBC治療現(xiàn)狀

熊去氧膽酸(UDCA)是唯一被批準(zhǔn)用于PBC治療的一線藥物，它被證實(shí)可以延長(zhǎng)無LT生存期，并且與發(fā)生肝臟相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[4]。雖然一經(jīng)確診即開始口服UDCA，但仍有部分患者病情可能會(huì)進(jìn)展，如：對(duì)UDCA應(yīng)答欠佳、耐受性差或依從性差的患者，他們?nèi)詫⒚媾R較高肝臟相關(guān)死亡及并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前新靶點(diǎn)、新藥物很多，但已明確療效及安全性的二線藥物仍較少。因此，當(dāng)前亟待解決的重要問題即尋找安全、有效的二線藥物，來降低PBC患者的LT需要率及死亡風(fēng)險(xiǎn)。

2 腸道菌群與PBC

近些年高通量測(cè)序、宏基因組測(cè)序等前沿技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，腸道菌群基因組、核心菌群分布特點(diǎn)越來越清晰。“腸-肝軸”預(yù)示著腸道微環(huán)境作為一個(gè)新角色參與多種肝臟疾病[6]。免疫受損、膽汁酸(bile acids，BA)代謝紊亂共同介導(dǎo)PBC的膽管損傷。而腸道菌群與免疫穩(wěn)態(tài)，BA與菌群的交互調(diào)節(jié)增加了PBC的患病風(fēng)險(xiǎn)。PBC地理聚集特點(diǎn)及病因?qū)W同樣顯示環(huán)境觸發(fā)及腸道微生物是潛在危險(xiǎn)因素[1]。但腸道微生態(tài)的改變是原因還是結(jié)果，目前尚未可知。

2.1 “腸漏”假說 生理狀態(tài)下，腸黏膜能夠分泌黏液、抗菌肽等物質(zhì)，腸壁內(nèi)、上皮間及黏膜固有層分布著多種免疫細(xì)胞及淋巴組織，腸內(nèi)共生微生物還具有拮抗病原菌的作用。這些“屏障”可以有效防御致病物質(zhì)，共同維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[7]。門靜脈收集來自腸道的血液，肝臟是過濾腸源性毒素和物質(zhì)的前線。正常免疫防御下部分微生物抗原隨循環(huán)進(jìn)入肝內(nèi)不會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生。但當(dāng)腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致腸道運(yùn)動(dòng)障礙和炎癥，屏障功能受損，潛在致病性物質(zhì)、細(xì)菌易位到肝內(nèi)膽道系統(tǒng)，將可能引發(fā)BEC損傷凋亡、肝內(nèi)炎癥及纖維化重塑[7-8]。對(duì)dnTGFβRIITLR2-/-小鼠結(jié)腸免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)并伴隨菌群紊亂，肝內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和膽管損傷程度相對(duì)于未敲除TLR2小鼠更加嚴(yán)重。并且在抗生素干預(yù)后得到緩解，菌群失調(diào)也得以改善[9]。而PBC患者受損膽管中檢測(cè)到屬于細(xì)菌壁成分的脂磷壁酸，同樣證實(shí)了細(xì)菌易位和疾病發(fā)展間的關(guān)聯(lián)[8]。

2.2 異常腸道淋巴細(xì)胞歸巢 與“腸漏”假說平行，Grant等提出了另一種“腸道歸巢”假說[10]。生理?xiàng)l件下，趨化因子(chemokine ligand，CCL)25和內(nèi)皮黏附分子(mucosal addressin cellular adhesion molecule 1，MAdCAM-1)的表達(dá)主要局限于腸道相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissues，GALT)。它們通過特定的趨化因子受體和整合素誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向腸道募集，這種趨向性是由腸樹突狀細(xì)胞表達(dá)的視黃醇?xì)浠刚T導(dǎo)的，肝樹突狀細(xì)胞并不具備這種能力。而原發(fā)性硬化性膽管炎合并炎癥性腸病患者(primary sclerosing cholangitis-inflammatory bowel disease，PSC-IBD)肝內(nèi)CCL25和MAdCAM-1表達(dá)增加。PBC中也有相似表現(xiàn)[10-11]。但機(jī)制暫未闡明，起初認(rèn)為這種“歸巢”是自身免疫相關(guān)肝病，為PSC-IBD特有，但最近發(fā)現(xiàn)這種T淋巴細(xì)胞的肝臟募集是慢性肝病的共同特征。在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和刀豆蛋白A誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型中MAdCAM-1消融帶來肝內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥的改善。并且在NASH中阻斷整合素α4β7可減輕肝臟炎癥和纖維化[11]。此外，腸道IgA能夠促進(jìn)共生細(xì)菌同時(shí)抑制病原菌，參與維持腸道穩(wěn)態(tài)。分泌IgA的漿細(xì)胞來源于GALT中的B淋巴細(xì)胞。整合素α4β7還調(diào)節(jié)IgA漿母細(xì)胞向肝臟遷移。Li等[12]和Moro-Sibilot等[13]發(fā)現(xiàn)除了腸黏膜外，肝臟是IgA反應(yīng)的替代效應(yīng)位點(diǎn)。PBC、PSC患者血清IgA常呈現(xiàn)升高同樣暗示著腸道的潛在參與。

2.3 交叉反應(yīng)和分子模擬 抗線粒體抗體(AMA)是PBC的標(biāo)志物之一，能夠特異性識(shí)別丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2) 硫辛酸結(jié)構(gòu)域。PBC典型免疫病理特征即針對(duì)PDC-E2的免疫耐受喪失，選擇性破壞BEC[14]。許多微生物都與人PDC-E2(hPDC-E2)具有高度相似的抗原表位，它們通過分子模擬觸發(fā)免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤定位，啟動(dòng)針對(duì)膽管的自身免疫反應(yīng)。大腸桿菌(E.coli)PDC-E2被證實(shí)能夠與hPDC-E2硫辛酸結(jié)構(gòu)域交叉反應(yīng)。還有ATP依賴性Clp酶等多種E.coli微生物蛋白都與hPDC-E2具有高度相似的氨基酸序列。利用E.coil感染的NOD.B6 Idd10/Idd18小鼠呈現(xiàn)類似PBC的自身抗體和肝臟病理表現(xiàn)。PBC中由E.coil引起的尿路感染的患病率高于其他慢性肝病，并且復(fù)發(fā)性尿路感染者AMA陽性比例也相對(duì)更高[15]。由此可見分子模擬機(jī)制與PBC發(fā)病密切相關(guān)。環(huán)境中普遍存在的新鞘氨醇桿菌屬溶芳熗單胞菌(N.Aromaticivorans)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列208-237與hPDC-E2具有高度的同源性。N.Aromaticivorans的兩種脂?；?xì)菌蛋白50 kD和47 kD在100%AMA陽性和12%AMA陰性患者中血清反應(yīng)滴度上升，并且效價(jià)比E.coil至少高出100倍。此外，德氏乳桿菌、肺炎克雷伯菌等都能與AMA交叉反應(yīng)，但它們的定位位點(diǎn)仍待明確[16]。

2.4 腸道菌群與BA的串?dāng)_ 作為重要的信號(hào)分子，BA參與脂質(zhì)及脂溶性維生素在腸道的消化、吸收等代謝過程，并且能夠通過信號(hào)通路影響免疫調(diào)節(jié)。初級(jí)BA在肝內(nèi)合成隨膽汁到達(dá)腸道，在微生物的修飾下轉(zhuǎn)化成次級(jí)BA。其中至少95%通過回腸有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、頂端鈉依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)體主動(dòng)重吸收或結(jié)腸被動(dòng)重吸收。然后它們被有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽和Na+/?；悄扄}共轉(zhuǎn)運(yùn)體再攝取到肝細(xì)胞中，隨新一輪BA一起通過膽鹽輸出泵再次排入腸道完成腸-肝循環(huán)，不斷地往復(fù)補(bǔ)足機(jī)體生理需要[17-18]。

BA多種化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)化離不開氨基酸的結(jié)合和菌群的生物修飾。因此，菌群發(fā)生變化必定會(huì)干擾BA池的組成及大小。脫羥基化、脫水、差向異構(gòu)及氨基酸的去結(jié)合是已知的4種微生物對(duì)BA的轉(zhuǎn)化機(jī)制。最近研究[19]還發(fā)現(xiàn)了第5種機(jī)制——膽堿骨架與氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸的酰胺共軛。研究[12]發(fā)現(xiàn)無菌小鼠與傳統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠的BA池存在差異。傳統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠BA池相對(duì)較小且?；?β-鼠膽酸比例減少。此外，腸道微生物群還通過法尼醇X受體 (farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)調(diào)節(jié)BA合成途徑酶的活性[10]。它們通過調(diào)節(jié)腸道FXR mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)下游成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)15/19表達(dá)減少，負(fù)調(diào)控膽固醇7α羥化酶的活性，從而干擾BA的合成[12]。研究[19]表明FXR-/-小鼠腸道通透性增加，腸黏膜完整性降低，并且缺失菌群對(duì)BA的調(diào)控作用。

不僅腸道菌群可以調(diào)節(jié)BA，反之亦然。BA通過自身毒性以及FXR和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(transmembrane G protein coupled receptor，TGR5)直接或間接影響腸道微生態(tài)。疏水性BA毒性作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死破壞肝臟及腸道穩(wěn)態(tài)主要通過3種機(jī)制。其一，直接誘導(dǎo)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激啟動(dòng)凋亡、衰老。BEC的凋亡會(huì)導(dǎo)致陰離子交換蛋白2表達(dá)減少，從而影響碳酸氫鹽屏障。其二，直接激活死亡受體Fas和TRAILR-2，然后caspase 8激活，促凋亡蛋白Bid裂解、易位，最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆死亡。其三，具有洗滌作用，能夠直接破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞崩壞裂解[10]。這也使BA表現(xiàn)出特殊的抗菌性。毒性膽汁淤積抑制對(duì)BA敏感的菌群，而E.coil等可耐受膽鹽壓力菌群則占據(jù)主導(dǎo)地位。這些潛在致病細(xì)菌能在炎癥條件下增殖并導(dǎo)致炎癥或影響自身免疫[20]。

BA是FXR的內(nèi)源性配體，BA的積聚會(huì)導(dǎo)致FXR激活，而FXR通過下調(diào)BA合成酶表達(dá)，減少BA合成并增加BA的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)BA水平降低，從而負(fù)調(diào)節(jié)BA誘導(dǎo)的FXR活化[21]。除了FXR-FGF15/19-CYP7A1信號(hào)通路，F(xiàn)XR還是回腸有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、頂端鈉依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)體的負(fù)調(diào)控因子。此外它還上調(diào)膽鹽輸出泵的表達(dá)，減少肝細(xì)胞在毒性BA中的暴露[18]。PBC二線藥物奧貝膽酸即通過激動(dòng)FXR負(fù)調(diào)控BA合成。另外研究[13]發(fā)現(xiàn)其具有部分預(yù)防腸道屏障功能障礙，減輕腸道炎癥的作用。膜結(jié)合型BA受體TGR5由腸內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌。TGR5激活后觸發(fā)下游胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的釋放。而GLP-1能夠防止BEC凋亡，促進(jìn)其對(duì)膽汁淤積的增殖修復(fù)。BA螯合劑消膽胺可以結(jié)合腸腔中的BA，因此被認(rèn)為能夠影響腸道菌群。最近一項(xiàng)研究[22]發(fā)現(xiàn)消膽胺可以調(diào)節(jié)FXR信號(hào)通路，并且還增強(qiáng)TGR5的腸道內(nèi)激活，進(jìn)而發(fā)揮膽管保護(hù)作用。一線藥物UDCA是一種親水性BA，其療效及安全性已被大量研究證實(shí)。PBC經(jīng)UDCA處理后BA結(jié)合/非結(jié)合和初級(jí)/次級(jí)比值逆轉(zhuǎn)[23]。Tang等[20]發(fā)現(xiàn)PBC患者腸道物種豐富度降低并且整體多樣性的顯著變化。使用UDCA 6個(gè)月后患者腸道富集的嗜血桿菌屬、鏈球菌屬和假單胞菌屬減少，未減少的韋榮菌屬可能與患者對(duì)UDCA應(yīng)答欠佳有關(guān)。而健康對(duì)照組中擬桿菌屬、薩特菌屬和顫螺菌屬在治療后擴(kuò)增。這證實(shí)了UDCA 可以緩解部分微生物失調(diào)。

3 微生態(tài)制劑與PBC

目前以“腸-肝軸”為核心機(jī)制，腸道微生物群為靶點(diǎn)的治療策略，已在NASH、肝性腦病等疾病中取得一定進(jìn)展[24-25]。微生態(tài)制劑可以通過直接增加腸道內(nèi)有益菌豐度，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，阻止致病菌增殖，使腸屏障功能得以改善，重塑腸道微環(huán)境，增強(qiáng)免疫防御[26]。鼠李糖乳桿菌GG(lactobacillus GG，LGG)是一種革蘭陽性菌，是目前研究相對(duì)較多的益生菌之一。研究[27]表明LGG能夠通過上調(diào)腸道FXR及FGF15表達(dá)活性，抑制BA從頭合成。LGG負(fù)反饋減少肝內(nèi)BA產(chǎn)生，并且影響腸道微生物群，改善膽管結(jié)扎小鼠的肝內(nèi)炎癥、BA水平及纖維化。并且使用FXR拮抗劑后上述現(xiàn)象受到阻礙[25]。目前，聯(lián)合使用微生態(tài)制劑干預(yù)PBC腸道菌群的研究[23]結(jié)果表明使用益生菌干預(yù)后腸道內(nèi)呈現(xiàn)有益菌屬豐度相對(duì)增加，潛在致病菌減少趨勢(shì)。此外，患者血清促炎細(xì)胞因子及纖維化指標(biāo)較對(duì)照組減低，這意味著引入有益菌使內(nèi)部菌群向健康人群腸道轉(zhuǎn)變，對(duì)延緩疾病進(jìn)展有幫助[28]。其他國(guó)內(nèi)、外相關(guān)研究正在進(jìn)行或計(jì)劃中(NCT03521297)。

微生態(tài)制劑治療一直是近年來極具爭(zhēng)議的話題。益生菌的劑量及菌種，菌群移植等研究目前仍在不斷探索。益生菌在PBC患病中的相關(guān)機(jī)制仍然需要大量臨床前數(shù)據(jù)來闡明。以腸道菌群作為突破口、菌群為靶標(biāo)的治療有望在未來打破PBC治療方案較少、較單一的問題，成為PBC新的治療策略。

4 總結(jié)與展望

PBC腸道菌群與免疫防御，BA合成、代謝過程的相關(guān)性越來越清晰明了。腸道微生態(tài)與PBC之間的深入研究能夠?yàn)橹委熖峁└噙x擇。但如何科學(xué)合理地在現(xiàn)有治療策略上應(yīng)用微生態(tài)制劑將是未來需要繼續(xù)探索的問題。另外，使用腸道菌群作為靶標(biāo)還面臨許多不足及難點(diǎn)需要解決。菌群與遺傳、年齡、性別、環(huán)境等因素相關(guān)，并且隨著生活方式的改變易出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。因此，腸道菌群如何作為精準(zhǔn)醫(yī)療的靶標(biāo)個(gè)性化用藥，還需多種族、長(zhǎng)時(shí)間、多中心研究來明確。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬銘涵負(fù)責(zé)撰寫文章及修改；劉彥琦負(fù)責(zé)指導(dǎo)及校正。