抗凍劑對蒸煮小龍蝦蝦仁凍融后品質的影響

胡筱波 陳文飛 顧澤茂 鄒圣碧 熊善柏 胡 楊

(1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學水產學院，湖北 武漢 430070；3.湖北萊克現代農業科技發展有限公司，湖北 潛江 433100)

冷鏈運輸是小龍蝦蝦仁產品最常用的運輸方式，這種方式最大程度地減少了微生物的繁殖，保持了產品質量，但運輸過程中的溫度波動會加速蝦肉蛋白質氧化變性，導致品質下降[1]。為了避免上述問題的發生，業界通常在冷凍蝦仁中添加抗凍劑[2]。磷酸鹽是常用于冷凍蝦類產品中的食品添加劑，可改善蝦肉的持水能力[3]。糖類抗凍劑(如海藻糖、山梨糖醇等)可抑制冷凍蝦內部冰晶的生長，防止蛋白質冷凍變性，保持肌肉組織結構完整[4]。張小利[5]研究了磷酸化海藻糖對冷凍南美白對蝦的抗凍效果，Zhang等[6]探究了海藻糖類抗凍劑對凍融過程中南美白對蝦冰晶生長的抑制作用，研究發現磷酸鹽與海藻糖可顯著提高南美白對蝦的抗凍能力，抑制冰晶的生長。目前，鮮有關于復合磷酸鹽、海藻糖與山梨糖醇等抗凍劑之間的協同作用對小龍蝦蝦仁抗凍效果的研究。研究擬以蒸煮小龍蝦蝦仁為研究對象，通過測定凍融后蝦仁持水力、蛋白變性與質構特征等指標的變化，探究不同質量分數的復合磷酸鹽、海藻糖與山梨糖醇分別對蝦仁抗凍能力的影響，并優化3種抗凍劑的復配方式，以期開發可量產的復合抗凍劑，為提升冷凍蝦仁的凍藏品質提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活克氏原螯蝦(20～29 g)：華中農業大學雙水雙綠研究院;

復合磷酸鹽：食品級，湖北興發化工有限公司；

海藻糖：食品級，純度98%，分子量378.33，河南喜萊客化工產品有限公司；

山梨糖醇：食品級，純度98%，分子量182.18，廣州賽國生物科技有限公司；

蔗糖、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水碳酸鈉、五水合硫酸銅、福林酚、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、鹽酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、甲醛：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

分析天平：AUY220型，島津企業管理(中國)有限公司；

電子天平：TX2202L型，島津企業管理(中國)有限公司；

冷凍離心機：J-26 XP 型，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；

離心機：TDL-5-A 型，上海菲恰爾分析儀有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型，上海精宏實驗設備有限公司；

質構儀：TA-XT2i型，英國StableMicro Systems 公司；

高速分散均質機：IKA2000型，德國IKA公司；

可見分光光度計：772S型，上海精密科學儀器有限公司；

臨界點干燥儀：HCP-2型，日本HITACHI公司；

低場核磁共振儀：NMI20-025V-1型，上海紐邁電子科技有限公司；

包埋機：JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司；

病理切片機：RM2016型，上海徠卡儀器有限公司；

凍臺：JB-L5型，武漢俊杰電子有限公司；

組織攤片機:KD-P型，科迪儀器設備有限公司；

染色機：Giotto型，意大利DIAPATH公司；

掃描電鏡:SU8010型，日本HITACHI公司；

真空封口機：DZ400-ZD型，上海余特包裝機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理 將20～29 g的鮮活小龍蝦沸水蒸煮4 min后，冰水冷卻6 min，去頭，去殼，去黃，取蝦仁，然后按料液比1∶3(g/mL)分別加入蒸餾水(空白組)、復合磷酸鹽溶液(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)、海藻糖溶液(2%，4%，6%，8%，10%)、山梨糖醇溶液(2%，4%，6%，8%，10%)、氯化鈉溶液(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)與蔗糖溶液(1%，2%，3%，4%，5%)(均為質量分數)浸泡3 h，浸泡時將溫度控制在4 ℃，取出后使用紗布擦干表面水分，裝入聚乙烯包裝袋中，進行真空包裝。

采用凍融循環試驗來處理樣品：將包裝好的蝦仁放入-18 ℃冰箱中，冷凍24 h，然后在4 ℃下解凍12 h，冷凍—解凍步驟循環5次，取第5次凍融后的蝦仁進行指標測定。

1.3.2 解凍損失率的測定 將浸泡過抗凍劑的新鮮蝦仁用紗布拭干水分，記錄重量m1。隨后，將解凍后的蝦仁用紗布拭干水分，記錄重量m2。按式(1)計算解凍損失率。

(1)

式中：

X——解凍損失率，%；

m1——解凍前蝦肉質量，g；

m2——解凍后蝦肉質量，g。

1.3.3 水分含量的測定 按GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》執行。

1.3.4 離心持水力的測定 稱取2.5 g左右的蝦仁，用脫脂棉包好，放入50 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min，剝去脫脂棉，再次稱重。按式(2)計算離心持水率。

(2)

式中：

Y——離心持水力，%；

m1——離心前蝦肉質量，g；

m2——離心后蝦肉質量，g。

1.3.5 質構測定 選取大小相近的10個樣品，取蝦仁2～3節部分，將其切成5 mm×4 mm×3 mm的均勻方塊試樣。采用TA-XT plus 物性儀進行測定。參數設定為：觸發類型Auto(自動)、測試速度1 mm/s、返回速度1 mm/s、壓縮比50%、兩次壓縮之間的停留時間為5 s。使用不銹鋼 P/36R 圓柱形壓縮探頭。

1.3.6 鹽溶性蛋白含量的測定 稱取5 g蝦肉樣品于燒杯中，加入10倍體積的高鹽磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mol/L NaCl+0.01 mol/L NaH2PO4+0.03 mol/L Na2HPO4)，在10 000 r/min轉速下均質90 s，4 ℃下浸提20 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，使用福林酚法測蛋白質含量。

1.3.7 總巰基含量的測定 向1 mL蛋白質溶液中加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(含8 mol/L 尿素、10 mmol/L EDTA、2% SDS，pH 6.8)和1 mL 0.1% DTNB溶液，混合均勻后于40 ℃水浴鍋中保溫25 min，取樣液測定其在412 nm處的吸光值。按式(3)計算總巰基含量。

(3)

式中：

C0——巰基的摩爾濃度，μmol/g；

A——412 nm的吸光值；

D——稀釋倍數；

ε——摩爾消光系數，13 600 mol·cm/L。

1.3.8 正交試驗設計 選擇復合磷酸鹽質量分數、海藻糖質量分數、山梨糖醇質量分數，進行三因素三水平的正交試驗。按1.3.1方法凍融5次后，以解凍損失率為響應指標研究3種抗凍劑之間的交互作用對小龍蝦蝦仁抗凍效果的影響。

1.3.9 低場核磁共振的測定 取樣品(約2.3 g)用核磁膜包裹放于直徑為25 mm 的玻璃管中，使用核磁共振分析軟件及CPMG序列對其進行T2信號采集，參數設為：時間點數據(TD)350 002，數據半徑(DR)1，90°脈寬(P1)9 μs，180°脈寬(P2)17.52 μs，采樣帶寬(SW)100 kHz，重復采樣等待時間(TW)4 000 ms，弛豫時間(TE)0.500 ms，模擬增益(RG1)3，重復采樣次數(NS)4，回波個數(NECH)7 000。

1.3.10 掃描電鏡 使用手術刀將蝦仁肌肉橫截面切成4 mm×4 mm×0.5 mm的薄片，用體積分數為2.5%的戊二醛溶液(溶劑為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)將蝦肉薄片固定24 h，然后使用HCP-2臨界點干燥儀對樣品進行臨界點干燥。離子濺射儀噴金后，使用掃描電子顯微鏡對樣品進行觀察，放大倍數為150倍。

1.4 數據處理與分析

采用Office 2019、SPSS 26處理分析數據，使用Origin 2018作圖，采用ANOVA進行方差分析，Duncan多重極差檢驗比較平均值在顯著性水平上的差異，P<0.05判定為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 抗凍劑添加量對蝦仁解凍損失率的影響

由圖1可知，與空白相比，經過抗凍劑浸泡處理的蝦仁在5次凍融循后，解凍損失率均較低。其中復合磷酸鹽組最低為14.67%，海藻糖組最低為17.44%，山梨糖醇組最低為16.82%，均低于氯化鈉與蔗糖處理的蝦仁，氯化鈉組最低為18.80%，蔗糖組最低為19.41%。在凍融循環過程中，冰晶的形成與重結晶會破壞肌肉組織結構[7-9]，海藻糖擁有較好的吸濕性，可吸附一部分水分[10]。此外，糖醇能束縛小分子水，以此降低冰晶對肌肉組織的物理損傷[11]。磷酸鹽則能夠增加肌肉結合水的能力，減少冷凍貯藏中的汁液損失[12]。

圖1 抗凍劑添加量對蝦仁解凍損失率的影響

2.2 抗凍劑添加量對蝦仁水分含量的影響

由圖2可知，復合磷酸鹽組的蝦仁凍融后仍保持較好的水分含量，均大于空白組的水分含量，因此復合磷酸鹽具有較好的保持水產品水分含量的作用，陳秋妹等[13]研究發現浸泡磷酸鹽溶液后，水產品的水分含量會增加。隨著糖類抗凍劑(海藻糖、山梨糖醇、蔗糖)添加量的增加，蝦仁水分含量先上升后下降，與齊賀[14]的研究結果一致，這是由于糖類分子的排阻作用，排出肌肉組織一部分水分，使體系結構更加穩定。

圖2 抗凍劑添加量對蝦仁水分含量的影響

2.3 抗凍劑添加量對蝦仁持水力的影響

由圖3可知，與空白組相比，抗凍劑均能顯著延緩凍融循環過程中蝦仁持水力的下降。當復合磷酸鹽添加量為2.5%時，蝦仁持水力最高為77.33%；當氯化鈉添加量為2.5%，持水力最高為74.67%，當海藻糖添加量為8%時，蝦仁持水力最高為75.35%；當山梨糖醇添加量為10%時，蝦仁的持水力最高為75.82%，當蔗糖添加量為3%時，持水力最高為74.46%。復合磷酸鹽對蝦仁持水力的保持效果較佳，但復合磷酸鹽添加量過高時，水分和蛋白含量因為滲透作用而減少，導致蝦仁持水力下降[15]。糖類可通過與水或冰的相互作用與冰晶結合，防止凍融過程中大冰晶的生成，減少了凍融過程冰晶對蝦仁肌肉組織的破壞[16]，Hassas-Roudsari等[17]也認為糖類分子是通過與冰晶表面結合來抑制冰晶的生長。此外，海藻糖可替代肌肉蛋白周圍的水分子，進一步減少冰晶生長對蝦仁肌肉組織的機械損傷。

圖3 抗凍劑添加量對蝦仁離心持水力的影響

2.4 抗凍劑添加量對蝦仁質構的影響

由圖4可知，相對于空白組，復合磷酸鹽使蝦仁的硬度下降，對蝦仁的咀嚼性無顯著影響，但對蝦仁的彈性影響較大，當復合磷酸鹽添加量為1%時，蝦仁彈性最高，隨著添加量增加，蝦仁彈性略微下降；氯化鈉對蝦仁硬度影響較小，略微提高了蝦仁的咀嚼性與彈性；海藻糖與山梨糖醇對蝦仁硬度無顯著影響，增加了蝦仁的咀嚼性與彈性，且蝦仁彈性隨著二者添加量的增加而增加；蔗糖組蝦仁的硬度、咀嚼性與彈性隨著蔗糖添加量的增加均先上升后下降。復合磷酸鹽可促進肌動球蛋白的解離，這可能是導致復合磷酸鹽組蝦仁硬度下降的原因，與董學文等[18-19]的研究結果一致。用復合磷酸鹽溶液浸泡，可顯著提高水產品的彈性，且能有效地延緩凍融過程中蝦仁彈性的下降[20]，但過量的磷酸鹽可能會使蝦肉的質構特性下降[21]。海藻糖與山梨糖醇能顯著維持蝦肉的彈性與咀嚼性，這可能是因為肌原纖維蛋白與滲入到肌肉組織中的糖類分子之間形成了穩定的化學鍵，這種非共價的相互作用抑制了凍融循環對蝦肉組織結構的破壞[22]。

圖4 抗凍劑濃度對蝦仁硬度、咀嚼性與彈性的影響

2.5 抗凍劑添加量對蝦仁鹽溶性蛋白的影響

由圖5可知，蝦仁鹽溶性蛋白含量隨著復合磷酸鹽和氯化鈉添加量的增加先上升后下降，然后略微上升，其中0.5%復合磷酸鹽與1%氯化鈉條件下蝦仁鹽溶性蛋白含量最高，分別為21.01，17.82 mg/g。與鹽類抗凍劑不同，隨著糖類抗凍劑添加量的增加，蝦仁鹽溶性蛋白的含量也隨之上升，其中8%海藻糖、10%山梨糖醇與5%蔗糖的鹽溶性蛋白含量最高，分別為20.15，19.76，19.21 mg/g。鹽類抗凍劑可使肌球蛋白從肌原纖維蛋白網狀結構中解離出來，促進凍融過程中蝦肉的鹽溶性蛋白溶出[23]，但也可能導致凍融循環過程中鹽溶性蛋白的損失，這也是高濃度鹽類抗凍劑使鹽溶性蛋白含量下降的原因[24-25]。同時，過高濃度的中性鹽會抑制蛋白質分子的溶解，甚至較低濃度下也可能抑制鹽溶性蛋白的提取[26]。蔗糖、山梨糖醇等小分子糖有較好的抑制肌肉中肌原纖維蛋白冷凍變性的效果[27]。

圖5 抗凍劑濃度對蝦仁鹽溶性蛋白含量的影響將

2.6 抗凍劑添加量對蝦仁總巰基含量的影響

由圖6可知，隨著復合磷酸鹽與氯化鈉添加量的增加，凍融循環后的蝦仁總巰基含量先上升后下降，其中1.5%復合磷酸鹽與1.5%氯化鈉添加量下的總巰基含量最高，分別為28.03，21.93 μmol/g。1.5%復合磷酸鹽組的鹽溶性蛋白含量較低，但總巰基含量較高，說明質量分數為1.5%的復合磷酸鹽仍有顯著抑制蛋白質氧化的效果。蝦仁總巰基含量隨海藻糖與山梨糖醇添加量的變化趨勢與鹽溶性蛋白變化一致，8%海藻糖、10%山梨糖醇與5%蔗糖的總巰基含量最高，分別為22.52，21.20，15.06 μmol/g。鹽類抗凍劑與糖類抗凍劑均能延緩凍融過程中蝦仁總巰基含量的下降。磷酸鹽會使蝦肉的蛋白質磷酸化，增強了蛋白質巰基與二硫鍵之間的相互作用，有效降低了凍融過程對巰基數量與蛋白質疏水性的影響[28-29]。海藻糖、山梨糖醇等糖類抗凍劑可抑制冰晶的形成，延緩巰基含量的下降[30]。

圖6 抗凍劑濃度對蝦仁總巰基含量的影響

2.7 正交試驗

從單因素試驗中可以看出，0.5%的復合磷酸鹽就有較佳的抗凍效果，海藻糖與山梨糖醇添加量為6%以上時，抗凍效果較佳，且6%，8%，10%海藻糖或山梨糖醇的抗凍效果接近。為減少磷酸鹽與糖的用量，響應低糖、低鹽的消費者與市場需求并基于成本考量，選用較低濃度的復合磷酸鹽、海藻糖與山梨糖醇作為試驗因素(見表1)，以凍融循環5次后蝦仁的解凍損失率為響應指標，進行三因素三水平的正交試驗，結果見表2。由表2和表3可知，3個因素對小龍蝦解凍損失率的影響大小依次為：山梨糖醇>海藻糖>復合磷酸鹽，且3種抗凍劑的添加量對蝦仁解凍損失率均有顯著影響(P<0.05)。由K值可得，組合A3B3C2為最佳組合，即1%復合磷酸鹽+6%海藻糖+6%山梨糖醇。

表1 正交試驗因素及水平編碼表

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

為了驗證正交試驗所得配方的抗凍效果，以表2中試驗9配方(1%復合磷酸鹽+6%海藻糖+6%山梨糖醇)為基礎，向其中添加少量的氯化鈉與蔗糖作為試驗組，以商業抗凍劑(4%蔗糖+4%山梨糖醇)為對照，測定各組的解凍損失率。由表4可知，相對于商業抗凍劑，4組復配抗凍劑的效果均較好，且無顯著差異。向表2中試驗9配方中加入少量氯化鈉與蔗糖未能顯著提高其抗凍效果，且綜合市場行情，表2中試驗9配方最為適合。

表4 驗證實驗結果?

2.8 抗凍劑對凍融過程中蝦仁水分分布及核磁共振成像的影響

小龍蝦的肌肉組織中水分的存在方式主要分3種，其對應的弛豫時間分別為T21、T22和T23。其中，T22(10～100 ms)對應的是不易流動水狀態，最能反映肌肉組織保持水的能力[31]。由圖7與表5可知，在凍融過程中，各組T22的信號強度均有所下降，且與空白組相比，抗凍劑組的變化幅度較小，凍融循環過程中冰晶的形成與增長會破壞小龍蝦蛋白質的空間結構[4]。T22越短說明水分與肌肉結合越緊密，由表5可知，未浸泡過抗凍劑的新鮮蝦仁的T22值為57.22 ms，而浸泡過抗凍劑的新鮮蝦仁T22值顯著小于這個值，說明使用復合磷酸鹽、海藻糖與山梨糖醇浸泡的蝦仁結合水的能力有所提高[2]，而凍融3次后，蝦仁的T22值與其峰面積比P22呈下降趨勢，可能是因為蝦仁的水分含量在凍融過程中逐漸減小[32]。復合磷酸鹽組蝦仁在凍融過程中T22與P22值下降，且P23值呈上升趨勢，這種現象可能與磷酸鹽保水的機制有關。磷酸鹽可增加蛋白質之間的靜電斥力，從而使肌原纖維蛋白質結構膨脹，截留更多的水分，水流動性的增加導致弛豫時間變長，使得部分水的弛豫時間大于100 ms[33]。海藻糖組與山梨糖醇可通過減少凍融過程中冰晶對蝦仁組織結構的破壞，保持蝦仁不易流動水的比例[14]。海藻糖與山梨糖醇組蝦仁在第三次凍融后，T22值變長，但P22值卻上升，這可能是肌原纖維的網狀結構被破壞，水的流動性增加，部分結合水轉變為不易流動水[34]。復配組在凍融循環中，低場核磁的信號強度變化幅度最小，且P22在5次凍融過程中，無顯著變化，說明復配抗凍劑對小龍蝦蝦仁具有較佳的抗凍保水效果。

圖7 經不同抗凍劑處理后蝦仁在凍融過程中水分分布的變化

表5 凍融過程水分弛豫時間和峰面積比的變化?

2.9 抗凍劑對蝦仁微觀結構的影響

不同抗凍劑處理后的小龍蝦在5次凍融循環后，小龍蝦肌肉的橫切面圖像如圖8所示：新鮮熟蝦的肌肉結構較為完整，肌原纖維連接較為緊密，而經過凍融循環后，各組蝦肉的結構均被破壞，肌肉結構呈現塊狀，且肌原纖維間出現縫隙，這可能是因為存在于肌原纖維附近的水分子在冷凍過程中形成冰晶，并不斷生長，擠壓肌原纖維，導致其結構破壞，出現縫隙[35]。與空白組相比，經過抗凍劑處理后的蝦仁在凍融后，肌肉組織間的縫隙較小，其中復配抗凍劑處理的樣品肌肉結構仍較為完整，且組織間緊密程度最接近新鮮蝦仁。單一抗凍劑處理的蝦仁中，復合磷酸鹽組的肌原纖維縫隙較小，海藻糖與山梨糖醇組的差異較小，這與解凍損失率的結果一致。肌原纖維間的縫隙大小與肌肉的持水力有密切的關系[36]，抗凍劑處理能顯著減小凍融后蝦肉組織的間隙，保持了肌肉的持水性。

白色箭頭所指為肌原纖維間的間隙

3 結論

復合磷酸鹽、海藻糖與山梨糖醇等抗凍劑對熟制的小龍蝦蝦仁仍然具有一定的抗凍保水效果。經1%復合磷酸鹽、6%海藻糖、6%山梨糖醇浸泡后的蝦仁具有較低的解凍損失，且凍融5次后，復配抗凍劑組的蝦仁微觀結構最接近新鮮組，抗凍劑可通過提高蛋白質與水的結合能力，顯著改善小龍蝦肌肉的持水能力，同時，抑制肌肉內部冰晶的形成與生長，防止了凍融過程中冰晶的移動，保持了肌肉結構的完整性。糖鹽類抗凍劑應用較為廣泛，但會對蝦仁產品的風味造成一定的影響。后續可研究其他種類的抗凍劑(蛋白水解類、抗凍蛋白)對熟制小龍蝦蝦仁的抗凍保水效果，力求取代磷酸鹽等抗凍劑在工業生產上的應用。