自噬相關蛋白在牙周病發生發展中作用的研究

郝 鴻

（華中科技大學醫院，湖北 武漢 430074）

牙周病是指由牙菌斑的刺激產物引起的牙周組織炎性疾病。牙周病會破壞牙支持組織，會導致牙齦紅腫、疼痛、出血，進一步發展后可導致牙槽骨的吸收，繼而導致牙齒松動、移位、脫落。正常情況下，自噬是一種常見的細胞現象，既能抑制也能促進細胞凋亡，這兩種反應在生物體內均廣泛存在。在營養缺乏時，自噬反應是一個細胞的促活反應機制，但是過度的自噬反應也會導致細胞死亡[1]?？谇恍l生不佳時，大量的細菌會影響牙周生態系統；一旦細菌數量過多，牙齦上皮細胞會處于相對營養匱乏的狀態，這極易導致其死亡。有研究[2-3]表明，自噬相關蛋白與牙周病的發生發展密切相關。本文針對自噬相關蛋白在牙周病發生發展中的作用進行初步探討?，F報告如下：

1 研究資料及方法

1.1 研究資料

選取我院近3 年（2019 年1 月至2022 年1 月期間）收治的牙周病患者86 例作為觀察組，選擇同期在我院進行同牙位正畸治療但牙周健康的患者30 例作為對照組。回顧分析兩組的臨床資料。觀察組：男47 例，女39 例；年齡20 ～55 歲，平均（37.54±2.16）歲。對照組：男17 例，女13 例；年齡21 ～53 歲,平均(37.23±2.36)歲。兩組的基本資料相比均衡性良好(P＞0.05) ，有可比性。

1.2 方法

兩組患者均分別采集牙周袋標本：采集菌斑，選擇吸潮紙，蘸取齦溝液，放入牙周袋15 s 后取出，剪下尖端放入離心管。將采集的樣本放入滅菌PBS 中保存（-20℃）。實驗室檢測方法：離心，棄上清，加入1 mL 膠原酶；放入孵育箱45 min(每5 min 振蕩1 次)；離心，棄上清，用10% 胎牛血清培養液沖洗，重復3次。吸出組織塊，種入培養瓶（含有2 mL 20% 胎牛血清培養液）中。加入500 μL 20% 胎牛血清培養液，待細胞從組織塊中游出，然后再添加培養液。置于顯微鏡下觀察。使用1 mg/L 脂多糖刺激上述細胞，引起致炎反應，作用時間為48 h。

1.3 觀察指標及判定標準

兩組均應用免疫組織化學染色法檢測微管相關蛋白1 輕鏈3 B（LC3B）、微管相關蛋白1 輕鏈3 Av1（LC3Av1）的表達情況。方法是：（1）蛋白樣本的制備。以細胞胰酶對樣本進行消化離心，棄上清，加入NP-40 裂解液。經超聲充分裂解后，以15000 r/min的速度離心5 min，取上清液。以BCA 法測定蛋白濃度。（2）蛋白質印跡：經15% SDS-PAGE 電泳使蛋白轉移至PVDF 膜上，以5% 脫脂奶粉封閉，用PBS-T 漂洗3 次。加入1:5000 稀釋兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1抗體，4℃孵育過夜后，用PBS-T 漂洗3 次。再分別加入帶有熒光基團標記的稀釋抗兔二抗、抗鼠二抗，孵育60 min，用PBS-T 漂洗3 次。最后鏡下觀察并攝片。（3）細胞免疫熒光染色。細胞用4%甲醛固定后，行PBS 漂洗，繼而用3% 過氧化氫甲醇乳液孵育。封閉滲透30 ～45 min，用PBS 清洗3 次，一抗為1:5000稀釋兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1 抗體，4℃孵育過夜；行PBS 清洗，加入1:2000 稀釋抗兔二抗，置入SP-9001C 液中室溫避光孵育60 min ；行PBS 清洗，以DAPI 工作液(1 mg/L) 進行細胞核染色，保持15 min后行PBS 清洗，封片劑封固。以熒光顯微鏡觀察取像。

1.4 統計學方法

用統計學軟件（SPSS 23.0 版本）分析數據。計量資料用均數± 標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 致炎反應作用后兩組LC3B 的表達情況

本研究的結果顯示，經免疫組織化學染色處理后，對照組、觀察組（0 h）樣品組織中均可見LC3B 的表達。脂多糖刺激6 h、12 h 后，對照組的LC3B 陽性表達率較低，而觀察組的LC3B 陽性表達率較高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，觀察組的LC3B 陽性表達率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，觀察組的LC3B陽性表達率增加，24 h、48 h 后有所下降。觀察組各時間段的LC3B 陽性表達率均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 致炎反應作用后兩組LC3B 的表達情況[例(%)]

2.2 致炎反應作用后兩組LC3Av1 的表達情況

本研究的結果顯示，經免疫組織化學染色處理后，對照組、觀察組（0 h）樣品組織中均可見LC3Av1 的表達。脂多糖刺激6 h、12 h 后，對照組的LC3Av1陽性表達率較低，而觀察組的LC3Av1 陽性表達率較高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，觀察組的LC3Av1 陽性表達率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，觀察組的LC3Av1 陽性表達率增加，24 h、48 h 后有所下降。觀察組各時間段的LC3Av1 陽性表達率均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 致炎反應作用后兩組LC3Av1 的表達情況[例(%)]

3 討論

牙周病是一種慢性細菌感染性疾病。該疾病的早期癥狀不易引起重視，等到有自覺癥狀時，它已進展至較為嚴重的程度，主要癥狀表現為牙齦紅腫、肥大或萎縮，嚴重者可致牙齒松動、咬合無力、持續鈍痛等。如不及時治療，可造成牙齒移位、脫落，嚴重影響健康[4-5]。目前臨床上公認菌斑是牙周病的致病因子。牙周病患者在早期往往沒有明顯的自覺癥狀，隨著病情的進展，很多患者會出現刷牙時牙齦出血的情況，有些患者還會出現牙齦腫脹不適、口腔異味等癥狀。如果病情不能得到有效控制，牙周病的癥狀會表現得越來越明顯，繼而出現牙齦腫痛、牙齒松動、牙齦“萎縮”、牙齒移位、咀嚼無力等癥狀，到疾病的晚期牙齒可能會自行脫落[6]。在免疫反應中，當自噬發生時，細胞溶質的成分會被降解，細胞胞質中會形成具有雙層膜杯狀分隔膜的自噬前體，溶酶體分隔膜不斷延伸，并逐步包裹細胞垃圾，形成密閉的自噬體囊泡。它可降解其包裹的細胞成分，并循環再利用降解產物。同時細胞自噬能為細胞部件提供燃料，供應能量，或提供材料來更新細胞部件。目前，臨床上已鑒定出許多自噬相關基因，且證實了細胞自噬在進化上具有高度保守性，其自噬機制和生理功能也得到了深入的研究。現代研究發現自噬的作用很多，包括改善免疫、代謝、內分泌、抗炎、提高線粒體效能、對抗感染、預防阿爾茲海默癥等退行性疾病、抑制腫瘤細胞等有益作用。LC3 是自噬研究中常用的檢測指標之一。當自噬形成時，LC3-Ⅰ可轉變為LC3- Ⅱ，繼而參與膜的延伸。在自噬過程中，LC3- Ⅰ在ATG7 和ATG3 泛素樣反應下參與活動，并與磷脂酰乙醇胺偶聯，繼而生成脂質化形式的LC3-Ⅱ。LC3- Ⅱ由于磷脂酰乙醇胺的修飾，導致電荷變化，使得其遷移更快，所以在SDS-PAGE 中顯得分子量比LC3- Ⅰ小。但由于ATG4B 僅存在于自噬早期階段的雙層膜上，且LC3在自噬過程中不斷被切割和降解，所以很難單純根據此指標判斷機體自噬是否被激活或抑制[7-8]。LC3- Ⅱ增多時，自噬活性增強，其被廣泛作為細胞自噬標志物。LC3- Ⅰ/ Ⅱ的形成和降解是一個動態過程[9]。牙周病患者外周血腫中自噬相關蛋白LC3B、LC3Av1 的表達水平明顯增高，可見自噬在其疾病的發生、發展中發揮了重要的作用[10]。LC3B 作為LC3 家族蛋白，是LC3 的一種，其同樣可以用作自噬的分子標志。通過使用抗LC3B 抗體檢測LC3B，可以大大增加相關實驗的成功率。我們通過使用1 mg/L 脂多糖刺激樣品細胞，在誘導或抑制后，觀察自噬過程，并檢測LC3Av1的表達水平。結果發現，無論是炎性細胞還是正常細胞都保持一定的自噬活性。而在牙周病患者的外周血腫中自噬相關蛋白LC3B、LC3Av1 的表達水平明顯增高。牙周病的病因包括局部因素和全身因素，兩者之間有密切的關系。例如牙結石的致病因素主要是表面形成的未鈣化菌斑的刺激及牙結石本身堅硬粗糙，對牙齦造成機械刺激；牙面色素有助于提供菌斑積聚和刺激牙齦的粗糙表面，繼而造成牙周組織炎癥，臨床研究多認為該因素可作為評估口腔衛生情況和相關微生物增殖情況的指標。食物被咬合壓力楔入相鄰兩牙的間隙內，是局部牙周組織被破壞最常見的原因之一。嵌塞的機械作用及細菌的定植，除可引起牙齦組織的炎癥及出血外，還可以引起牙齦退縮、牙槽骨吸收和口臭等。咬合關系不正?；蛞Ш狭α坎粎f調可引起牙周支持組織損傷，當咬合力超過牙周組織的承受范圍時，就有可能造成牙周組織的損傷。上述因素均會引起口腔感染，繼而導致細胞自噬的激活。在脂多糖的刺激下LC3 蛋白表達增多，表明自噬增強，提示自噬可參與牙周炎的病理發展。但具體起著保護作用還是病理作用，尚無充分的證據證實，只能提示自噬與牙周炎相關。在熒光顯微鏡下觀察自噬形成，可見多個明亮的綠色熒光斑點，故可采用計數法來評價自噬活性的高低。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，在顯微鏡下可照射被檢物體，使之發出熒光，從而觀察物體的形狀及其所在位置。臨床中熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。一些物質本身雖不能發出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發出熒光。在熒光顯微鏡技術中，將標記熒光素的純化肌動蛋白顯微注射入樣本細胞中，可以將產生的綠色熒光蛋白基因與某種蛋白質基因融合，便可直接在活體狀態下觀察到該蛋白在活細胞內的動態變化。LC3 的熒光顯微鏡檢測方法仍存在一些缺陷，比如臨床還沒有建立起統一標準的試驗技術路線，試驗者執行操作還不夠規范；檢驗中熒光斑細胞比例和表達的量化路徑較缺乏。再比如定量單個細胞LC3 熒光斑的表達中，計算每個轉染細胞的平均熒光值中還沒有確切的量化標準；因為LC3 熒光斑具有較高的時間依賴性，長時間下可能會導致其蓄積，加之各種環境因素、操作技術均會影響檢測結果，從而造成結果誤差。所以優化相關檢測技術，深入研究更符合自噬生理學功能的檢測技術具有重要的意義。目前，越來越多的研究表明自噬會參與牙周病的發病機制，但LC3B、LC3Av1 在牙周病發生發展中的作用機制還需進一步在相關細胞實驗中探討分析。本研究的結果顯示，在脂多糖的刺激下，自噬相關蛋白LC3B、LC3Av1 的表達水平會明顯上調。這表明，自噬可參與牙周炎發生發展的過程。

綜上所述，自噬相關蛋白在牙周病的發生發展中可影響炎性細胞的生成，且表達量隨炎癥發展而增加。臨床上仍需進一步深入研究自噬與牙周病發生發展的關系，繼續探討牙周病發生發展中自噬相關蛋白的表達及作用。