痰標本分枝桿菌培養陽性患者血雙因子（IFN-γ和IL-2）檢測結果的分析

李月水，于橋愛，唐柳生，廖家吉，李世立★

（1.廣西壯族自治區胸科醫院，廣西 柳州 545005 ；2.柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001）

目前，結核病的確診主要依賴于病原學和分子生物學檢測，分枝桿菌培養陽性可作為診斷結核分枝桿菌（MTB）感染和非結核分枝桿菌（NTM）感染的重要依據。有研究指出，在我國有部分肺結核患者得不到病原學診斷，只能根據臨床癥狀被認定為疑診對象，這對于控制結核病的傳播是一大阻礙[1]。當人體感染結核分枝桿菌后，體內會出現特異性效應T 淋巴細胞。致敏的T 淋巴細胞在體外再次受到結核分枝桿菌特異抗原的刺激時，會分泌并釋放IFN-γ。本文對2022年1 月—6 月到我院就診且痰標本分枝桿菌培養陽性患者檢測的血液雙因子（IFN-γ 和IL-2）結果進行回顧性分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2022 年1 月—6 月到我院就診且痰標本經分枝桿菌培養分離出結核分枝桿菌的患者456 例（MTB 組）和非結核分枝桿菌感染患者75 例（NTM 組）為研究對象。MTB 組：男338 例，女118 例；年齡13 ～91 歲，平均54.8 歲。NTM 組：男46 例，女29例；年齡18 ～88 歲，平均60.9 歲。

1.2 儀器與試劑

雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測試劑盒由廣州迪澳醫療科技有限公司提供，羅氏培養基、抗酸染液和鑒定培養基（TCH 和PNB）由珠海貝索公司提供，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液和 6% 的 NaOH 消化液等相關試劑均為本室按《結核病診斷細菌學檢驗規程》配制[2]，培養箱由上海智誠有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 血液前處理 1）采集4 ～6mL 的肝素抗凝全血，稀釋于4mL 1640 培養基中，再傾斜45°緩緩加入提前準備的4mL 的淋巴分離液離心管中，1000g 離心20 分鐘。2）離心分離出PBMC 細胞如云霧狀，隨后吸取云霧狀細胞層到另一支重新準備的15mL 離心管中，并提前加入1640 培養基至8mL，隨后混勻。離心機600g 離心7 分鐘。3）棄上清液并混勻沉淀，加1640 培養基至6mL 混勻，350g 離心7 分鐘。4）棄上清液并加500μL AIM-V 培養基配置適宜濃度的細胞懸液。5）每一例標本設置3 孔分別為:陰性對照孔N，刺激蛋白孔T，陽性對照孔P；提前:N 孔加50μL AIM-V，T 孔加50μL 刺激蛋白，P 孔加50μL 陽性刺激物；每個孔加入100μL 細胞懸液，以37°及適宜濕度的5% 二氧化碳培養箱孵育16 ～20 小時。

1.3.2 ELASA 酶聯免疫實驗 取出培養好的樣本，吸取上清液利用雙抗夾心法進行ELISA 檢測，得到原始OD 值，再將數據導入該試劑盒的判讀軟件中進行判讀。IFN-γ 的T-N（刺激蛋白的刺激值減去陰性對照的差值）≥7pg/mL 為陽性；IL-2 的T-N ≥20為陽性；IFN-γ 的T-N ＜7pg/mL,P-N( 陽性刺激物的刺激值減去陰性對照的差值) ≥35pg/mL 為陰性；IL-2 的T-N ＜20，P-N ≥130pg/mL 為陰性。

1.3.3 分枝桿菌培養 先用消化液將患者痰液進行消化15min 后加緩沖液中和,3000r/min 離心30min 后取沉淀0.2mL 接種于羅氏培養基中, 斜放 24 小時后置于 37℃的孵育箱中進行培養，陽性后經萋尼氏染色確定為抗酸桿菌再用鑒定培養基（TCH 和PNB）進行初步菌種鑒定，TCH 培養基有菌生長或無菌生長而PNB 培養基無菌生長判斷為結核分枝桿菌，TCH培養基和PNB 培養基均有菌生長判斷為非結核分枝桿菌。質控標準菌株為H37RV。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0 統計軟件進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2 檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。不同方法檢測結果的一致性用kappa 檢驗判別，kappa ≥0.75 表示具有高度一致性，kappa ≥0.4 且＜0.75 表示具有較好一致性，kappa ＜0.4 表示具有較差一致性。

2 結果

MTB 組 中 檢 測 出IFN-γ+、IL-2+ 雙 陽 性234例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+單陽性5 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性57 例，陽性占比87.5%（399/456）；NTM 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性37 例，陽性占比50.7%（38/75）。雙因子（IFN-γ和IL-2）檢測結果與分枝桿菌培養結果的一致率為81.3%（436/531）。MTB 組與NTM 組間的差異有統計學意義(χ2=59.98，P＜0.01)。詳見附表。

256 例IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性患者中，有結核分枝桿菌感染234 例，占90.6% ；175 例IFN-γ+、IL-2- 單陽性患者中，有結核分枝桿菌感染160 例，占91.3% ；6 例IFN-γ-、IL-2+ 單陽性患者中，有結核分枝桿菌感染5 例，占83.3% ；94 例IFN-γ-、IL-2- 雙陰性患者中，有結核分枝桿菌感染57 例，占60.6%（399/437）。以分枝桿菌培養法為金標準，雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測法診斷結核分枝桿菌感染的特異度為50.7%, 敏感度為87.5%，陽性預期值為91.3%，陰性預期值為39.4%；kappa 檢驗，K=0.33，兩者具有較差一致性。詳見附表。

附表雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測與痰標本分枝桿菌培養陽性結果的比較

3 討論

肺結核是結核分枝桿菌感染肺部引起的疾病。大多數結核分枝桿菌存在于肺部病灶壞死組織中，患者痰液中含有一定量的結核分枝桿菌，通過痰液分枝桿菌培養可以診斷患者是否患有結核病。當結核分枝桿菌感染人體后，人體主要依靠細胞免疫清除結核分枝桿菌，機體CD4+輔助性T1 淋巴細胞(Thl 細胞) 與CD8+細胞毒性T 淋巴細胞(CTL 細胞)是主要的效應細胞。由CD4+Thl 細胞產生的Thl 細胞因子是抗結核感染的重要因子，其中γ-干擾素(IFN-γ)與白細胞介素(IL)-2 是兩種典型的Thl 細胞因子，在結核分枝桿菌感染后這兩種細胞因子的水平會有所變化[3-5]。本研究顯示雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測診斷結核分枝桿菌感染的陽性預期值為91.3%，敏感度為87.5%，說明大多數情況下通過IL-2 與IFN-γ 的檢測可以反映由結核分枝桿菌致敏后的Thl 細胞分泌的細胞因子水平，從而輔助診斷肺結核。

IFN-γ 是重要的細胞免疫因子, 可增強宿主抵御結核分枝桿菌感染的能力, 具有促進T 淋巴細胞增殖、激活單核巨噬細胞、改善細胞免疫功能等作用[6-7]。IL-2 則是免疫調節因子，可以促進T 細胞增殖、促進B 細胞分泌抗體等，其免疫調節作用屬于免疫細胞增殖與應答調節的中心環節[8]。但單個因子IFN-γ 或IL-2 檢測，無法區分活動性結核和潛伏感染，其陽性結果對臨床診斷結核病的幫助不大，更多的意義在于陰性排除，但其特異度有限，在排查過程中，也易出現假陽性情況，臨床需要更好的免疫手段來進行結核病的輔助診斷。本研究顯示雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測的相關特異度僅為50.7%, 這印證了此觀點。雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測技術是將人外周血單個核細胞與融合蛋白SAT6-CFP10-Rv1985c 在細胞培養板上共培養，結核病患者體內的結核特異性 T 細胞由于記憶反應而分泌IFN-γ 和IL-2 因子，再利用酶聯免疫吸附法，檢測培養上清中的IFN-γ 和IL-2 的濃度，來判斷其是否存在結核分枝桿菌特異性的細胞免疫反應。如果雙陽性：IFN-γ+、IL-2+，表明樣本中存在針對結核分枝桿菌的特異性細胞免疫反應，警示可能存在活動性結核病。如果單陽性：IFN-γ+、IL-2-/IL-2+、IFN-γ-，表明樣本中存在針對結核分枝桿菌的特異性細胞免疫反應，提示結核感染。本研究MTB 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性234 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性5 例，說明在456 例分枝桿菌培養結果為結核分枝桿菌陽性的患者中，有51.3%（234/456）的患者通過雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結果得到活動性結核病警示，有87.5%（399/456）的患者得到結核感染提示。

當樣本被污染、實驗操作不當或堪薩斯分枝桿菌、海氏分枝桿菌和蘇爾加分枝桿菌等存在交叉反應時，檢驗結果可能出現假陽性。文中75 例分枝桿菌培養結果為NTM 的患者中，有50.7% 的患者出現雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陽性〔其中IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例〕，相關陰性預期值僅為39.4%。有資料報道，宮頸病變、腫瘤與IFN-γ 和IL-2也呈一定的相關性[9-12]。因此，當雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陽性結果與臨床診斷不符時，應參照分枝桿菌培養結果進行鑒別診斷，不能將雙因子（IFN-γ和IL-2）檢測作為治療或其他臨床管理的唯一依據，應結合患者的臨床癥狀/ 體征、病史、其他實驗室檢查結果及治療反應等情況綜合考慮[13-15]。

文中456 例分枝桿菌培養結果為結核分枝桿菌陽性的患者中，有12.5%（57/456）的患者出現雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陰性。原因可能是檢測者為陳舊性肺結核患者[16]、淋巴細胞功能異常[16]、實驗操作不當、免疫功能受損或者發生 Hook 效應等，是否屬實，需要進一步的研究和探討。

通過雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測，解決了臨床過去存在的一些難以解決的難題，根據相關研究，特異性T 淋巴細胞分泌的IL-2 與IFN-γ 可以區分結核感染的不同階段，IL-2 能夠作為一種合適的生物標記物用來區分結核感染患者的不同臨床階段[1，17]。“雙陽”結果能夠高度警示“活動性結核”，提高活動性結核和菌陰結核病的檢出率，提高非結核人群中的鑒別診斷特異性，有助于預測結核菌被激活為活動性病變的風險，但雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測容易出現假陰或假陽性結果，通過 kappa 檢驗，kappa值僅為0.33， 一致性較差。經分析，kappa 值較低的主要原因是NTM 樣本檢測結果與臨床診斷不相符，本研究中將NTM 作為對照組，而雙因子檢測中對感染堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)，蘇爾加分枝桿菌(M.szulgai)，海氏分枝桿菌 (M.marinum) ，戈登分枝桿菌(M.gordonae) 時，可能存在交叉影響，直接導致部分NTM 的檢測結果不準確。

綜上，雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結果陽性不能作為結核病確診證據，應進一步進行結核病的醫學及診斷評估（如細菌抗酸染色涂片及培養、胸部X光等）。但雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結果，一方面能夠很好地用于結核感染的排除，另外一方面，通過單陽向雙陽的變化，可以在一定程度上預測結核菌活動性病變的風險，還能為患者的治療過程提供監控依據。