HSF1與Beclin1在胰腺癌組織中相關性表達及其與患者預后的關系

吳灶璇 王桂良 肖歸 邱萍 徐林芳 龔敏 李興 文劍波

(1南方醫科大學附屬萍鄉醫院消化內科，江西 萍鄉 337000；2海南醫學院護理學院)

胰腺癌是預后最差的消化系統惡性腫瘤之一，治療難度大，病死率高〔1〕。癌基因的異常擴增和表達、抑癌基因的突變或失活及多個基因的協同作用等在胰腺癌的發生中起重要作用〔2〕。熱休克轉錄因子(HSF)1在癌細胞中，通過DNA修復、調節細胞周期、調節能量代謝、調節細胞凋亡和自噬等途徑，對促進癌細胞的存活及增殖發揮重要作用〔3〕。自噬在癌形成過程中發揮重要作用，通過感受器和效應器共同調節多途徑的生物學過程，在維持細胞自我平衡過程中起重要作用〔4〕。Beclin1是連接自噬與凋亡通道的關鍵分子，能誘導細胞自噬性死亡及凋亡、抑制炎癥擴散、預防基因突變及抑制腫瘤細胞的增殖〔5〕。HSF1和Beclin1均與胰腺癌的發生發展相關，但二者在胰腺癌中表達的相關性及其影響胰腺癌發生發展的機制尚不清楚。本研究通過檢測HSF1和Beclin1 mRNA和蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織中表達的情況，探討二者與胰腺癌生物學行為的關系。

1 材料與方法

1.1患者與試劑 根據采用國際抗癌聯盟(UICC)和美國腫瘤聯合委員會(AJCC)2017年第6版分期標準，收集南方醫科大學附屬萍鄉醫院2015年1月至2020年9月6例新鮮切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌及癌旁組織、196例石蠟標本胰腺癌組織標本，其中包括45例經手術切除的Ⅰ期和Ⅱ期患者和151例不能手術而經超聲內鏡引導細針穿刺(EUS+FNA)診斷的Ⅲ期和Ⅳ期患者。正常胰腺組織來源于胰腺體尾部β細胞瘤鄰近胰腺組織及外傷后經手術部分切除的胰腺組織。臨床病理學參數包括性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、淋巴結轉移、遠處轉移、分化程度和TNM分期。研究方案已經過南方醫科大學倫理委員會批準。兔抗HSF1、磷酸化HSF1抗體、兔抗Beclin1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1蘇木素-伊紅(HE)染色 組織固定、脫水，切片為5 μm厚的薄片，烤片后進行二甲苯脫蠟，常規酒精水化，蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質，進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后進行鏡下觀察。

1.2.2HSF1和Beclin1免疫組織化學染色 組織經10%甲醛固定后脫水、包埋，切片，微波修復，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，血清封閉。依次加入一抗、二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，中性樹膠封片。根據染色強度和陽性細胞百分比來評分進行定性分析。出現棕黃色顆粒沉淀為陽性表達。強度評分：0(無染色)、1(淺黃色)、2(棕黃色)及3分(棕褐色)。比例積分：0(<10%陽性細胞)、1(≥10%且<25%陽性細胞)、2(≥25%且<50%陽性細胞)、3(≥50%且<75%陽性細胞)和4分(≥75%陽性細胞)。強度評分和比例積分相乘產生最終的染色評分：<7分定義為低表達，≥7分定義為高表達。采用 Image-pro plus6.0分析光密度進行定量分析，以積分光密度(IOD)除以面積(Area)計算平均光密度(AOD)，即AOD = IOD/Area。

1.2.3RNA分離和實時熒光定量聚合酶鏈反應(Rt-PCR) 以Trizole法提取RNA。使用MMLV逆轉錄，得到cDNA。引物合成及探針修飾由上海生物工程有限公司完成，HSF1擴增引物：正向5′-CCATCCTGCGGGAGAGTGAA-3′，反向5′-GGCTCCGAGCCTGTCAGCA-3′(擴增長度為106 bp)。Beclin1擴增引物：正向5′-GATTGAAGACACAGGAGGCAGT-3′，反向5′-GTGAGGACACCCAAGCAAGAC-3′(擴增長度為97 bp)。GAPDH擴增引物：正向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′；反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′(擴增長度為102 bp)。反應條件：95℃ 3 min行變性，95℃循環15 s，56℃ 10 s，72℃下進行45 s，循環35次。然后計算HSF1 mRNA和Beclin1 mRNA的ΔCt值均數和標準差，所有標本的mRNA的相對表達量均經GAPDH校正。

1.2.4Western印跡 稱取80～100 mg癌組織，按1∶10的比例加入細胞裂解液，勻漿后離心，取上清液提取總蛋白，用酶標儀定量。按每孔40 μg蛋白量上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉，PVDF膜置于一抗稀釋液(1∶1 000稀釋)中4℃過夜，洗膜，再置于二抗稀釋液(1∶5 000稀釋)中室溫孵育2 h，洗膜，加入化學發光底物，顯影，GAPDH作為內參照，用Quantity One4.3.1凝膠圖像分析系統分析蛋白灰度值。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、秩和檢驗、方差分析、Spearman相關性分析、Pearson相關性分析。采用Log-rank檢驗比較生存率的差異，以單因素分析和Cox回歸分析預后獨立影響因素。

2 結 果

2.1HSF1、Beclin1 mRNA及蛋白在新鮮胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織的表達 與癌旁組織和正常組織相比，癌組織中總HSF1 mRNA和蛋白、磷酸化(p)-HSF1蛋白及Beclin1 mRNA和蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 HSF1和Beclin1蛋白在癌組織、 癌旁組織和正常組織中的表達

表1 HSF1和Beclin1 mRNA及蛋白在癌組織、 癌旁組織和正常組織中的表達

2.2HSF1蛋白在石蠟標本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織表達 HE染色顯示，正常組織和癌旁組織中可見典型的外分泌腺腺泡結構，細胞排列規則。癌組織中無典型的腺泡樣結構，細胞排列不規則，細胞大小不一，邊界不清，核大深染，無核仁，腺管呈條索狀；石蠟標本癌組織中，總HSF1蛋白在癌組織中細胞質和細胞核均有表達，主要表達在細胞質，部分表達在細胞核，p-HSF1部分表達在細胞質，有較多的表達在細胞核。在石蠟標本癌旁組織和正常組織中，總HSF1主要表達在細胞質，而細胞核中表達較少，細胞質和細胞核中p-HSF1表達極少。與癌旁組織和正常組織相比，總HSF1蛋白在胰腺癌中的表達顯著性升高。HSF1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表達趨勢是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表達趨勢是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。見圖2。

圖2 HSF1蛋白在石蠟標本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織中表達(×400)

2.3Beclin1蛋白在石蠟標本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織的表達 Beclin1蛋白主要于細胞質內表達，癌組織中Beclin1蛋白明顯高于癌旁組織和正常組織，癌旁組織和正常組織間無明顯差異，Beclin1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表達趨勢是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表達趨勢是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。見圖3。

圖3 Beclin1蛋白在石蠟標本胰腺癌組織、癌旁組織和正常組織中表達(免疫組織化學染色，×400)

2.4HSF1和Beclin1蛋白表達構成比與胰腺癌患者臨床病理學特征的關系 對構成比分析，HSF1與Beclin1蛋白水平均與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置均不相關(P>0.05)，與分化程度、TNM分期、遠處轉移及淋巴結轉移均相關；HSF1表達與分化級別負相關，與TNM分期正相關，與遠處轉移及淋巴結轉移正相關，Beclin1蛋白表達與分化級別負相關，與TNM分期正相關，與遠處轉移及淋巴結轉移正相關(均P<0.05)。見表2。

表2 HSF1或Beclin1蛋白表達構成比在胰腺癌臨床病理參數的關系(n)

2.5HSF1和Beclin1蛋白表達豐度與胰腺癌組織中患者臨床病理學參數的關系 HSF1蛋白表達豐度與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤位置不相關(P>0.05)，而與淋巴結轉移、TNM分期、遠處轉移和分化程度相關(P<0.05)。表達趨勢是：淋巴結轉移(+)>淋巴結轉移(-)，遠處轉移(+)>遠處轉移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化；Beclin1蛋白表達豐度與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤位置不相關(P>0.05)，而與淋巴結轉移、TNM分期、遠處轉移和分化程度相關(P<0.05)。表達趨勢是：淋巴結轉移(+)>淋巴結轉移(-)，遠處轉移(+)>遠處轉移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化。見表3。

表3 HSF1蛋白或Beclin1蛋白表達豐度與胰腺癌 臨床病理參數的關系

2.6HSF1和Beclin1表達相關性 HSF1高表達患者中Beclin1高表達率為71.8%；HSF1低表達患者中Beclin1低表達率為80.0%，二者呈正相關(r=0.743,P<0.05)。HSF1和Beclin1表達豐度呈正相關(P<0.001)。見圖4。

2.7HSF1和Beclin1對胰腺癌預后的危險因素分析 單因素分析顯示腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結狀態及Beclin1及HSF1表達水平與胰腺癌預后密切相關。進一步多因素Cox回歸分析顯示淋巴結轉移、TNM分期、分化程度、遠處轉移、HSF1及Beclin1表達水平是胰腺癌預后的獨立危險因素。見表4。

2.8HSF1聯合Beclin1對胰腺癌患者生存的預測價值 手術治療的Ⅰ+Ⅱ期患者和不能手術的Ⅲ+Ⅳ期患者的生存率的順序均為：HSF1(低表達)+Beclin1(低表達)>HSF1(低表達)+Beclin1(高表達)>HSF1(高表達)+Beclin1(低表達)>HSF1(高表達)+Beclin1(高表達)。見圖5。

圖4 HSF1和Beclin1表達豐度的相關性

表4 HSF1和Beclin1對胰腺癌預后的危險因素分析

圖5 HSF1聯合Beclin1對不同分期胰腺癌患者生存的預測價值

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，其發生是個多基因、多步驟、多階段的演變過程，在演變過程中涉及很多基因的表達異常〔1〕。炎癥、凋亡、應激、自噬等病理過程也參與了癌癥的發生和發展〔6〕。HSF1是和應激相關的一個非常重要的轉錄因子，在胰腺癌組織中，通過DNA修復、調節細胞周期、調節能量代謝、調節細胞凋亡和自噬等途徑，對促進癌細胞遷移、侵襲、增殖和癌細胞新陳代謝發揮重要作用〔7〕。HSF1通過調節Smac激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)抑制線粒體凋亡途徑，從而促進胰腺癌的發生〔8〕。Ke等〔9〕發現AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)激活的缺失會放大HSF1的活性，從而促進胰腺癌的侵襲和轉移。自噬在腫瘤發生與發展中逐漸成為癌癥基因靶向治療的一個新熱點〔10〕。多種基因與自噬的發生有關，其中Beclin1是調節細胞自噬中最重要也是最關鍵的因子之一，HSF1能參與多條信號通路調控自噬相關基因調節自噬調節腫瘤的發生和發展〔11〕，其中對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是一條關鍵的通路〔12〕。mTOR同時影響Beclin1的表達，通過與磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)形成復合物來調控細胞自噬，這樣形成了由P13K、Beclin1、mTOR和HSF1為相互作用的自噬交互調控網絡，參與癌細胞正常生理生長、細胞周期演進和自噬〔13〕。研究HSF1與自噬相關基因Beclin1的相關性具有重要意義。

本研究說明，正常胰腺和癌旁組織中HSF1以非激活的形式主要存在于細胞質，而細胞核中很少，在致癌因素的刺激下，部分HSF1被磷酸化而激活轉移至細胞核發揮促進腫瘤的作用。HSF1的升高在胰腺癌的發生和進展中起重要作用。HSF1在胰腺癌組織中表達升高的機制尚未完全闡明，一般認為癌細胞在致癌因子的作用下，核因子(NF)-κB、MAPK、mTOR等通路激活，促進HSF1 mRNA轉錄導致蛋白表達升高〔14〕。HSF1對惡性腫瘤具有多效性作用，對DNA修復、血管生成、代謝、遷移和侵襲及轉移中都發揮作用，還能促進局部組織環境的改變以支持腫瘤發展。在之前的研究中，Beclin1在膠質母細胞瘤、肝細胞癌、食管癌、非小細胞肺癌、膀胱尿路上皮腫瘤和乳腺癌中檢測到下調〔15～20〕，而在結直腸癌、卵巢癌和胃癌中檢測到Beclin1上調〔21～23〕，說明不同癌組織Beclin1表達與臨床病理特征的相關性不同。本研究結果說明，Beclin1在胰腺癌組織中表達上調，且Beclin1水平的升高在胰腺癌進展中起著重要作用。Beclin1在腫瘤中的作用是自噬和凋亡細胞死亡途徑復雜系列相互作用的結果。本研究結果說明，HSF1、Beclin1均是影響胰腺癌預后的獨立危險因素。HSF1高表達且Beclin1高表達利于腫瘤生長，HSF1低表達且Beclin1低表達不利用腫瘤生長。

綜上，HSF1、Beclin1在胰腺癌組織中表達升高，且兩者之間的表達呈正相關，能獨立或協同影響胰腺癌的病程進展，其具體機制尚需進一步研究。